【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术属于微生物制药领域，涉及一株生产环三肽类化合物(jbir-15、aspochracin、sclerotiotide c)的工程曲霉菌aspergillus sp.l14-oe::laea2及其构建方法与应用。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、近年来，海洋真菌成为了海洋源天然产物研究的热点材料，其发酵代谢物中发现了许多有生物活性的化合物。黑曲霉作为丝状真菌的一员，具有丰富的生物合成基因簇，能控制其产生大量的次级代谢产物，主要包括吡喃酮类，生物碱类，酰胺类，环肽类，聚酮类和甾醇等六大结构类型。这些化合物具有重要的药用价值，在农业和医药方面有巨大的潜在应用前景。
2、大部分丝状真菌的生物合成基因簇在实验室培养条件下处于沉默状态，具有很高的产生新颖或高产化合物的潜力。基因组挖掘策略(包括转录调控因子的调控、启动子工程以及异源表达)近年来已被成功开发并引入，以激活沉默/低表达的生物合成基因簇，用于新颖或者高产的真菌次级代谢产物的发现。次级代谢产物的产生受一个复杂的基因调控网络控制，包括全局调控。laea是丝状真菌的第一个全局调控因子，于2004年首次在构巢曲霉中发现，对真菌的发育和次生代谢具有显著的协调作用。
3、环脂肽广泛存在于海洋被囊类动物、海绵、藻类、真菌、细菌的代谢产物中。aspochracin类型环三肽的结构通常包含一个独特的大环和一个聚酮侧链。对于大环，最常见特征是由一个十二元环(由丙氨酸-缬氨酸-鸟氨酸组成)或十三元环(由丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸组成)组成。只有15种asp
4、迄今为止，尚未有高产jbir-15、aspochracin和sclerotiotide c环脂肽类化合物的菌株的相关报道，且其生物活性的研究也较少。全局调控因子挖掘策略可能是一种有效的途径，能挖掘真菌中沉默未知的生物合成簇，以及提高活性小分子化合物的产量。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种高产环三肽类化合物的曲霉(aspergillus sp.)l14-oe::laea2及应用，解决了jbir-15、aspochracin和sclerotiotide c等环三肽类化合物产量低下的问题，并发现其在抗肿瘤、抗氧化药用领域的新应用，有望作为药物先导物应用于工业化生产中。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种高产环三肽类化合物的曲霉(aspergillus sp.)l14-oe::laea2，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m20232057，保藏日期2023年10月27日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
4、本专利技术将全局调控因子laea片段基因过表达于原始菌株黑曲霉l14(采自中国辽宁省大连市星海湾的矶海绵内共生黑曲霉)基因组中，获得能够高产jbir-15、aspochracin、sclerotiotide c这三种环三肽类化合物的工程菌株曲霉l14-oe::laea2。
5、本专利技术曲霉l14-oe::laea2构建方法具体步骤如下：
6、(1)使用pcr及双酶切技术，获取黑曲霉l14中的全局调控因子laea片段基因，构建含有所述基因的重组质粒pcambia-1301:laea，所述全局调控因子laea核苷酸序列如seqid no.1所示；
7、(2)将步骤(1)中获得的质粒导入e.coli dh5α感受态中，挑取转化子摇菌过夜，进行质粒的扩增并提取；
8、(3)使用冻融法将步骤(2)中获得的质粒导入农杆菌agl-1中，并小提质粒；
9、(4)在乙酰丁香酮的诱导下，通过农杆菌介导真菌转化法将步骤(3)中的质粒转入至黑曲霉l14的基因组中，获得高产jbir-15、aspochracin、sclerotiotide c的工程菌株曲霉l14-oe::laea2。
10、本专利技术还提供了所述的曲霉l14-oe::laea2在生产环三肽类化合物中的应用，所述应用是将所述曲霉l14-oe::laea2发酵培养，发酵液分离纯化，获得环三肽类化合物；所述环三肽类化合物包括化合物(i，aspochracin)、化合物(ⅱ，jbir-15)和化合物(ⅲ，sclerotiotide c)。
11、
12、本专利技术所述的曲霉l14-oe::laea2发酵培养的方法包括以下步骤：
13、(1)将曲霉l14-oe::laea2接入pda培养基30℃活化3-4d，然后接种到pdb培养基中，30℃、180-200rpm培养3d，获得种子液；
14、(2)将所述种子液以体积浓度1-5％(优选3％)的接种量接种至察氏培养基中，30℃、180-200rpm培养15d，获得发酵液。
15、优选的，步骤(1)中所述pda培养基的组成为：葡萄糖20g/l，马铃薯200g/l，琼脂15-18g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然；pdb种子培养基终浓度组成为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。
16、优选的，步骤(2)中所述察氏培养基组成：蔗糖30g/l，硝酸钠3g/l，七水硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，磷酸氢二钾1g/l，溶剂为水，ph自然。
17、本专利技术所述发酵液分离纯化的方法为：将发酵液用八层纱布过滤，使菌液与菌丝体分离，取菌液加入等体积乙酸乙酯，萃取(优选萃取2次，合并上层萃取液)，取上层液减压旋蒸浓缩至干燥状态，即得到发酵粗提物浸膏；将粗提物浸膏用色谱甲醇溶解后，再用色谱甲醇进行稀释，接着用0.22μm有机滤头进行过滤，滤液采用高效液相色谱的分析型色谱柱进行等度洗脱，以体积比35:65的乙腈:水为流动相，收集第6-7min、8-9min、10.8-11.2min的流出液，旋蒸去除溶剂后，在25℃下干燥，分别获得化合物(i)、化合物(ⅱ)和化合物(ⅲ)。
18、所述高效液相色谱条件：液相仪器：uv-vis；检测器：岛津spd-m40；高效液相输液泵：岛津lc-20at；色谱条件：分析型色谱柱，c18色谱柱4.6×250mm；流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产环三肽类化合物的曲霉(Aspergillus sp.)L14-OE::laeA2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20232057，保藏日期2023年10月27日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述曲霉L14-OE::laeA2在生产环三肽类化合物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是将曲霉L14-OE::laeA2发酵培养，发酵液分离纯化，获得环三肽类化合物；所述环三肽类化合物包括化合物(I)、化合物(Ⅱ)和化合物(Ⅲ)；
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述曲霉L14-OE::laeA2发酵培养的方法包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述察氏培养基组成：蔗糖30g/L，硝酸钠3g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，磷酸氢二钾1g/L，溶剂为水，pH自然。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液分离纯化的方法为：将发酵液用八层纱
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述高效液相色谱条件：液相仪器：UV-VIS；检测器：岛津SPD-M40；高效液相输液泵：岛津LC-20AT；色谱条件：分析型色谱柱，C18色谱柱4.6×250mm；流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长210nm，进样体积10μl。
8.一种权利要求1所述曲霉L14-OE::laeA2制备的环三肽类化合物在制备抗氧化活性药物中的应用。
9.一种权利要求1所述曲霉L14-OE::laeA2制备的环三肽类化合物在制备抑制肿瘤细胞活性药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括人脑胶质细胞株HEB、人肝癌细胞株Hep-G2。
...【技术特征摘要】
1.一种高产环三肽类化合物的曲霉(aspergillus sp.)l14-oe::laea2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20232057，保藏日期2023年10月27日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述曲霉l14-oe::laea2在生产环三肽类化合物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是将曲霉l14-oe::laea2发酵培养，发酵液分离纯化，获得环三肽类化合物；所述环三肽类化合物包括化合物(i)、化合物(ⅱ)和化合物(ⅲ)；
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述曲霉l14-oe::laea2发酵培养的方法包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述察氏培养基组成：蔗糖30g/l，硝酸钠3g/l，七水硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，磷酸氢二钾1g/l，溶剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：章华伟，李梦诗，符志杨，吕华伟，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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