【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、微小核糖核酸(microrna,mir)已成为近年来一类公认的高度保守的短非编码核糖核酸，长约19至25个碱基，通过以序列特异性的方式控制靶向信使核糖核酸(mrna)的稳定性和翻译，在各种生物过程中发挥重要作用。其中，mir-29b为mir-29家族成员之一，已经检测到mir-29b可通过靶向相关mrna参与细胞外基质相关蛋白的翻译过程，包括胶原、纤维蛋白和弹性蛋白等，调节器官和组织的纤维化和细胞外基质重塑；且mir-29b也已被证实通过靶向抑制磷脂酰肌醇三羟基激酶(phosphoinositide-3kinase，pi3k)的85阿尔法亚基(p85α)来抑制经典通路pi3k/akt通路的激活，进而调控细胞自噬调控的关键蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达。
2、细胞自噬为机体内的一个正常生理过程，参与细胞稳态和生存机制。除此之外，细胞自噬也有其他广泛的生物功能，包括先天性免疫与适应性免疫的调节。细胞自噬激活似乎是细胞的一种自我保护机制，参与宿主对病原刺激的应答。此外，细胞自噬水平的损伤可导致组织纤维化。
3、临床上，角膜损伤是导致视力下降及盲的主要原因之一。角膜损伤愈合是一个复杂的过程，涉及细胞死亡、迁移、增殖、分化，先天性免疫反应和细胞外基质重塑。深层的角膜损伤则因严重的炎症反应及角膜基质层内肌成纤维细胞的增殖导致角膜混浊。目前针对角膜混浊的治疗方式主要是角膜移植术，但因供体有限等原因仍存
4、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bmscs)是一种多能干细胞。研究发现，bmscs来源的外泌体(exosomes，exos)是一种脂质双分子层结构囊泡，内涵dna、rna、mirna等成分，可发挥生物调控作用。且其较易获得和保存，因此可以用作再生医学中基于bmsc的替代疗法，在药物递送及临床疑难问题的治疗中备受关注。目前，mir-29b-3p过表达工程外泌体在改善角膜损伤修复中的作用尚未见相关文献报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和应用。本专利技术提供的mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体可以减轻眼角膜损伤修复中角膜组织炎症反应及角膜组织纤维化，有效改善角膜混浊，进行角膜损伤修复。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
3、a、骨髓间充质干细胞的提取与培养
4、b、转染骨髓间充质干细胞
5、将传至第三代的骨髓间充质干细胞以2×106个每毫升的密度接种于六孔板，24小时后按照lipofectamine 3000转染试剂盒的说明书将mir-29b-3p模拟物转入细胞中；
6、c、外泌体分离
7、收集转染后的骨髓间充质干细胞培养上清液，离心后弃去沉淀，上清经超速离心后收集沉淀，pbs重悬，再次超速离心后弃上清，收集沉淀溶于pbs中，得到mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体溶液。
8、在其中一些优选的实施例中，所述mir-29b-3p的核苷酸序列如seq id no:1所示。
9、在其中一些优选的实施例中，所述转染操作具体为：向试管中加入无血清细胞培养基、lipofectamine 3000转染试剂，混匀后室温静置5分钟，然后再向其中加入无血清细胞培养基、mir-29b-3p模拟物、助转染试剂，混匀后室温静置20分钟；然后向其中补入无血清培养基，在孵箱中转染24小时。
10、本专利技术的第二方面，提供了根据上述的mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法制备得到的mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体。
11、本专利技术的第三方面，提供了上述mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体在制备治疗眼角膜损伤药物中的应用。
12、在其中一些优选的实施例中，所述的眼角膜损伤为机械性外伤所致的眼角膜损伤。
13、在其中一些优选的实施例中，所述药物包括mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体以及药学上可接受的辅料。
14、在其中一些优选的实施例中，所述药物以mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体为唯一活性组分。
15、在其中一些优选的实施例中，所述药物为眼液剂或注射剂。
16、具体地，当所述药物为眼液剂或注射剂时，还包括稀释液，所述稀释液优选为pbs。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
18、本专利技术针对眼角膜损伤修复治疗中无特效改善角膜混浊药物，减轻眼角膜损伤修复中角膜组织炎症反应及角膜组织纤维化是治疗角膜混浊的关键。根据细胞自噬在眼角膜组织损伤修复中发挥重要作用的特点，提供了mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体。通过实验证实，mir-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体在动物水平上可有效缓解小鼠眼角膜机械性损伤修复中眼角膜组织炎症反应，抑制小鼠眼角膜组织纤维化，缓解了小鼠机械性损伤所致的角膜混浊，且治疗效果明显优于小鼠骨髓间充质干细胞外泌体，为机械性眼角膜损伤治疗提供了一种新思路，具有制备机械性眼角膜损伤救治药物的前景。
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1.一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述转染操作具体为：向试管中加入无血清细胞培养基、Lipofectamine 3000转染试剂，混匀后室温静置5分钟，然后再向其中加入无血清细胞培养基、miR-29b-3p模拟物、助转染试剂，混匀后室温静置20分钟；然后向其中补入无血清培养基，在孵箱中转染24小时。
4.根据权利要求1-3任一项所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法制备得到的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体。
5.权利要求4所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体在制备治疗眼角膜损伤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的眼角膜损伤为机械性外伤所致的眼角膜损伤。
7.一种治疗眼角膜损伤的药物，其特征在于，所述药物包括miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体以及药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的治疗眼角膜损伤的药物，其特征在于，所述药物以miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体为唯一活性组分。
9.根据权利要求7所述的治疗眼角膜损伤的药物，其特征在于，所述药物为眼液剂或注射剂。
...【技术特征摘要】
1.一种mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述mir-29b-3p的核苷酸序列如seq id no:1所示。
3.根据权利要求1所述的mir-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述转染操作具体为：向试管中加入无血清细胞培养基、lipofectamine 3000转染试剂，混匀后室温静置5分钟，然后再向其中加入无血清细胞培养基、mir-29b-3p模拟物、助转染试剂，混匀后室温静置20分钟；然后向其中补入无血清培养基，在孵箱中转染24小时。
4.根据权利要求1-3任一项所述的mir-...
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