【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌及其应用。
技术介绍
1、2-吡喃酮-4,6-二羧酸(2-或alpha-pyrone-4,6-dicarboxylic acid，cas:72698-24-9)是一种含有吡喃环的拟芳香二元羧酸化合物，具有和对苯二甲酸(tpa)相类似的分子结构和化学性质，可以与各种二元醇或羟基酸发生脱水缩聚反应生成聚酯类高分子材料。与聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)相比，2-吡喃酮-4,6-二羧酸衍生的聚合材料具有良好的热稳定性、粘结性和生物可降解性，因此可以作为一种优良的生物可降解聚合材料。鉴于这些特性，2-吡喃酮-4,6-二羧酸被认为是具有较好应用前景的用来合成芳香族聚酯材料的替代合成单体。此外，2-吡喃酮-4,6-二羧酸还可以作为锂离子电池电解液的添加剂和含有放射性元素铯废水处理的络合剂。
2、2-吡喃酮-4,6-二羧酸很难通过化工方法合成。目前，已报道的合成方法主要有以单环芳香族化合物(例如原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草醛、香草酸等等)为底物的微生物转化合成和以葡萄糖为原料的微生物从头合成。otsuka等利用共表达鞘氨醇单胞菌(sphingomonaspaucimobilis)来源的原儿茶酸-4,5-二氧化酶复合体ligab和4-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱氢酶ligc的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)ppy1100菌株，以原儿茶酸为底物可以合成大约10g/l的2-吡喃酮-4,6-二羧酸(otsuka y,nakamura m,eta
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种重组大肠杆菌，该菌株利用葡萄糖生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的产量和葡萄糖的转化率得到进一步提高，遗传稳定性强。本专利技术的另一目的是提供该重组大肠杆菌的应用以及发酵生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的方法。
2、为实现上述目的，本专利技术创造性地发现了能够有效提升2-吡喃酮-4,6-二羧酸积累的改造靶点，即通过在生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的重组大肠杆菌中上调表达外源血红蛋白基因vhb，和/或下调表达内源丙酮酸激酶基因pyka和/或pykf，并对上述两个改造靶点进行组合适配优化，显著提高了2-吡喃酮-4,6-二羧酸的产量和葡萄糖的转化率。
3、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
4、第一方面，本专利技术提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是利用crispr-cas9基因编辑技术，在生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的重组大肠杆菌基因组上上调表达外源血红蛋白基因vhb，和/或下调表达内源丙酮酸激酶基因pyka和/或pykf而得到的一种基因工程重组大肠杆菌。
5、在一种实施方式中，构建所述重组大肠杆菌所用的出发菌株，既可以是产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的重组大肠杆菌，也可以是产原儿茶酸的重组大肠杆菌或莽草酸途径调控后的重组大肠杆菌。
6、优选地，以重组大肠杆菌pdc14作为出发菌株进行构建，所述pdc14的保藏编号为cgmcc no.24557(已在中国专利技术专利202210626629.1中披露)。
7、在一种实施方式中，通过在大肠杆菌基因组上上调表达外源血红蛋白基因vhb可以提高2-吡喃酮-4,6-二羧酸的产量和葡萄糖的转化率；
8、优选地，利用基因组编辑技术例如crispr-cas9基因编辑技术在大肠杆菌基因组上的ybfc_ybfq两个基因中间整合外源血红蛋白基因表达盒；
9、优选地，所述血红蛋白基因vhb来源于透明颤菌(vitreoscilla sp.)，其基因序列如seq id no:1所示，其编码蛋白如ncbi上登录号为aaa27585.1所示的氨基酸序列；
10、优选地，利用其自身启动子pvhb上调vhb的表达，所述启动子位于vhb起始密码子atg上游，其序列如seq id no:4所示；
11、在一种实施方式中，通过在大肠杆菌基因组上下调表达内源丙酮酸激酶基因pyka和/或pykf可以提高2-吡喃酮-4,6-二羧酸的产量和葡萄糖的转化率。
12、因此，具体地，本专利技术提供以下任一种重组大肠杆菌：
13、(1)该重组大肠杆菌上调表达外源血红蛋白基因vhb，且与出发菌株相比，该重组大肠杆菌具有降低的丙酮酸激酶基因pyka的表达水平和或本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌（Escherichia coli），其特征在于，所述重组大肠杆菌是通过在基因组上上调表达外源血红蛋白基因，和/或下调表达内源丙酮酸激酶基因，所述血红蛋白基因为VHb，丙酮酸激酶基因为pykA和/或pykF。
2.如权利要求1所述产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，是以能够合成PDC的大肠杆菌作为出发菌株，优选地出发大肠杆菌是保藏编号为CGMCC No.24557的重组大肠杆菌PDC14。
3.根据权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，所述血红蛋白基因VHb来源于透明颤菌（Vitreoscilla sp.），所述丙酮酸激酶基因pykA和pykF为大肠杆菌内源基因；
4.根据权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，通过在大肠杆菌基因组上上调表达血红蛋白基因VHb；
5.根据权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，通过在大肠杆菌基因组上下调表达内源丙酮酸激酶基因pykA和/或pyk
6.如权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因工程改造采用基因组编辑手段，更具体采用如CRISPR-Cas9基因编辑技术实现基因的表达调控。
7.如权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.26905。
8.权利要求1-7任一项所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌在生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸中的应用。
9.一种生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的方法，包括利用权利要求1-7中任一项所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组菌株进行发酵以产生2-吡喃酮-4,6-二羧酸。
10.如权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述以酵是在有氧条件下，利用无机盐培养基，以葡萄糖为碳源；更优选地，发酵pH为5-8，发酵温度为25-42℃，溶氧为10%-50%，通过分批补料发酵的方式生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸。
...【技术特征摘要】
1.一种产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌（escherichia coli），其特征在于，所述重组大肠杆菌是通过在基因组上上调表达外源血红蛋白基因，和/或下调表达内源丙酮酸激酶基因，所述血红蛋白基因为vhb，丙酮酸激酶基因为pyka和/或pykf。
2.如权利要求1所述产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，是以能够合成pdc的大肠杆菌作为出发菌株，优选地出发大肠杆菌是保藏编号为cgmcc no.24557的重组大肠杆菌pdc14。
3.根据权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，所述血红蛋白基因vhb来源于透明颤菌（vitreoscilla sp.），所述丙酮酸激酶基因pyka和pykf为大肠杆菌内源基因；
4.根据权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，通过在大肠杆菌基因组上上调表达血红蛋白基因vhb；
5.根据权利要求1所述的产2-吡喃酮-4,6-二羧酸重组大肠杆菌，其特征在于，通过在大肠杆菌基因组上下调表达内源丙酮酸激酶基因py...
【专利技术属性】
技术研发人员：王钦宏，吴凤礼，王淑彩，张媛媛，宋国田，高树楷，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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