【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及生产多巴黄素重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、甜菜素是一种水溶性含氮生物碱类色素，因最早发现于甜菜根中而得名，包括甜菜红素(betacyanin)和甜菜黄素(betaxanthin)两类。甜菜黄素的合成以左旋多巴(l-dopa)为前体物，在4，5多巴双加氧酶(4,5-dopa-extradiol-dioxygenase，doda)的催化下左旋多巴分子上c4和c5之间的环链接，产生不稳定中间产物开环多巴(4,5-seco-dopa)。开环多巴不稳定，继而由氨基和开环产生的醛基通过分子内缩合，形成甜菜素的骨架结构及生色基团——甜菜醛氨酸。甜菜醛氨酸和不同的胺或氨基酸分子缩合可以生成不同的甜菜黄素，甜菜醛氨酸与左旋多巴缩合生成多巴黄素(dopaxanthin)(图1)。
2、国内外研究表明，目前甜菜黄素主要是植物提取和半合成的方法获得。植物提取法包括水浸提、冷浸提、常温浸提或索氏抽提等方法从物原料中提取，但是产量较低。其次就是半合成方法，通过碱性水解法从纯化的甜菜素中分离得到甜菜醛氨酸，甜菜醛氨酸与胺缩合，形成甜菜黄素(fernando gandía-herrero,francisco garcía-carmona,josefaescribano.development of a protocol for the semi-synthesis and purificationof betaxanthins.phytochemical analysis.2006 17:262-269
3、maria alejandra guerrero-rubio等人在2l的生物反应器中全细胞催化96h获得多巴黄素为148.25毫克(maria alejandra guerrero-rubio,rosalia lopez-llorca,paula henarejos-escudero,francisco garcia-carmona and fernando gandia-herrero.scaled-up biotechnological production of individual betalains in amicrobial system.microbial biotechnology.2019 12(5):993-1002.)。这些得率比通过半合成获得的值高4个数量级。由此可见，目前的方法生产多巴黄素效率仍然较低，难以满足大规模工业化发酵生产的要求。本专利技术公开的生产方法可以有效解决多巴黄素合成效率低的问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供了高效全细胞催化生产多巴黄素和发酵法从头合成多巴黄素的方法及所用到的基因工程重组菌。所述基因工程重组菌中表达4，5多巴双加氧酶(ec1.13.11.-)基因的工程重组菌，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、需钠弧菌(vibrio natriegens)等原核生物作为全细胞催化剂，以左旋多巴作为底物，实现了左旋多巴到多巴黄素的全细胞催化合成。
2、本专利技术首先提供一种4，5多巴双加氧酶，其是ncbi登录号为hq656022.1、hq656027.1、bcd59217.1、kil68483.1、xp_021847013.1、b6f0w8.1、kaf8894833.1、aki33702.1、bah66636.1、xp_024341686.1、wp_012222467.1、kai0713625.1、wp_114729264.1、wp_061274009.1、tfk45546.1、mk922469.1、tfk87692.1、kaj7778768.1、wp_015213489.1、mg882761.1、wp_000188362.1、aj580598.1、pfh53562.1、kaj6606184.1、xp_007396372.1、kaf8626304.1、kaf8352199.1、kaf8655009.1、gje88060.1、xp_040761208.1、kaf8894833.1、kaf8954968.1、kaf9464553.1、kai3607810.1、rdx52882.1、xp_046091100.1、kaf7777649.1、qop57916.1、pch38639.1、kah9948136.1所示的酶；
3、本专利技术也提供所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因。
4、本专利技术进一步提供一种用于全细胞催化生产多巴黄素的基因工程重组菌，所述基因工程重组菌是通过在宿主细胞中表达所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因而获得，优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、需钠弧菌(vibrio natriegens)，优选地，以大肠杆菌，例如大肠杆菌bl21(de3)或bl21(de3)plyss或rosetta(de3)或rosetta(de3)plyss或origami中的任意一种菌株作为宿主细胞。
5、在一个具体实施例，所述出发菌大肠杆菌t004。t004的申请号为201711003046.9，保藏号为cgmcc no.14247，于2017年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
6、具体地，所述4，5多巴双加氧酶的编码基因连接至pet30a或pet28a或pet26b中任意一种表达载体上导入宿主细胞而获得。
7、本专利技术提供一种催化生产多巴黄素的全细胞催化剂，其培养所述基因工程重组菌并表达4，5多巴双加氧酶基因，得到全细胞催化剂；具体地，利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷或乳糖诱导4,5多巴双加氧酶基因表达，获得全细胞催化剂。
8、本专利技术还提供一种全细胞催化生产多巴黄素的方法，其采用所述的基因工程重组菌，或所述的全细胞催化剂，以左旋多巴作为底物，全细胞催化合成多巴黄素。
9、优选地，所述全细胞催化的体系中左旋多巴浓度为1-100g/l，全细胞催化剂用量为1-100od600；所述全细胞催化体系的反应体系为m9培养基、磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、乙酸盐缓冲液中的任意一种；反应ph为5-8；反应温度为20-40℃；反应时间为0.5-24h。
10、本专利技术提供一种从头生产多巴黄素的大肠杆菌(escherichia coli)重组菌，其在出发大肠杆菌中通过将ygid编码框替换成表达所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因而得到；优选地，所述出发菌株为大肠杆菌t004；
11、另外，优选地在出发大肠杆菌中，通过将ygid编码框替换成表达盒1(m1-93-gddoda)，所述表达盒的序列如seq id no:本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种4，5多巴双加氧酶，其特征在于，其是NCBI登录号为HQ656022.1、HQ656027.1、BCD59217.1、KIL68483.1、XP_021847013.1、B6F0W8.1、KAF8894833.1、AKI33702.1、BAH66636.1、XP_024341686.1、WP_012222467.1、KAI0713625.1、WP_114729264.1、WP_061274009.1、TFK45546.1、MK922469.1、TFK87692.1、KAJ7778768.1、WP_015213489.1、MG882761.1、WP_000188362.1、AJ580598.1、PFH53562.1、KAJ6606184.1、XP_007396372.1、KAF8626304.1、KAF8352199.1、KAF8655009.1、GJE88060.1、XP_040761208.1、KAF8894833.1、KAF8954968.1、KAF9464553.1 、KAI3607810.1、RDX52882.1、XP_046091100.1、KAF7777649
2.如权利要求1所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因。
3.一种用于全细胞催化生产多巴黄素的基因工程重组菌，其特征在于，所述基因工程重组菌是通过在宿主细胞中表达如权利要求1所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因而获得，优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、需钠弧菌（Vibrio natriegens），优选地，以大肠杆菌，例如大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS或Rosetta(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS或Origami中的任意一种菌株作为宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的基因工程重组菌，其特征在于，所述4，5多巴双加氧酶的编码基因连接至pET30a或pET28a或pET26b中任意一种表达载体上导入宿主细胞而获得。
5.一种催化生产多巴黄素的全细胞催化剂，其特征在于，培养如权利要求3至4任一项所述基因工程重组菌并表达4，5多巴双加氧酶基因，得到全细胞催化剂；具体地，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖诱导4,5多巴双加氧酶基因表达，获得全细胞催化剂。
6.一种全细胞催化生产多巴黄素的方法，其特征在于，采用如权利要求4至5任一项所述的基因工程重组菌，或权利要求5所述的全细胞催化剂，以左旋多巴作为底物，全细胞催化合成多巴黄素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的体系中左旋多巴浓度为1-100 g/L，全细胞催化剂用量为1-100 OD600；所述全细胞催化体系的反应体系为M9培养基、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、乙酸盐缓冲液中的任意一种；反应pH为5-8；反应温度为20-40℃；反应时间为0.5-24 h。
8.从头生产多巴黄素的大肠杆菌（Escherichia coli）重组菌，其特征在于，在出发大肠杆菌中通过将ygid编码框替换成表达如权利要求2所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因而得到；优选地，所述出发菌株为大肠杆菌T004；
9.权利要求8中任一项所述的重组菌或由其传代而产生的重组菌在生产多巴黄素的应用。
10.一种生产多巴黄素的方法，包括利用权利要求8所述的重组菌进行发酵以产生多巴黄素。
...【技术特征摘要】
1.一种4，5多巴双加氧酶，其特征在于，其是ncbi登录号为hq656022.1、hq656027.1、bcd59217.1、kil68483.1、xp_021847013.1、b6f0w8.1、kaf8894833.1、aki33702.1、bah66636.1、xp_024341686.1、wp_012222467.1、kai0713625.1、wp_114729264.1、wp_061274009.1、tfk45546.1、mk922469.1、tfk87692.1、kaj7778768.1、wp_015213489.1、mg882761.1、wp_000188362.1、aj580598.1、pfh53562.1、kaj6606184.1、xp_007396372.1、kaf8626304.1、kaf8352199.1、kaf8655009.1、gje88060.1、xp_040761208.1、kaf8894833.1、kaf8954968.1、kaf9464553.1 、kai3607810.1、rdx52882.1、xp_046091100.1、kaf7777649.1、qop57916.1、pch38639.1、kah9948136.1所示的酶。
2.如权利要求1所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因。
3.一种用于全细胞催化生产多巴黄素的基因工程重组菌，其特征在于，所述基因工程重组菌是通过在宿主细胞中表达如权利要求1所述的4，5多巴双加氧酶的编码基因而获得，优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌（escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）、需钠弧菌（vibrio natriegens），优选地，以...
【专利技术属性】
技术研发人员：王钦宏，田立岩，江小龙，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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