本发明专利技术公开了一种甲酸利用的解脂耶氏酵母及其制备方法。本发明专利技术对实验室驯化的耐受高浓度甲酸盐的野生型解脂耶氏酵母进行了转录组测序，通过代谢网络模型预测的通量分布数据辅助转录组学分析后，发现了一条来自于解脂耶氏酵母菌株内源的甲酸代谢途径，即依赖于乙醛酸和苏氨酸驱动的丝氨酸双循环途径（gSer‑tSer双循环）。本发明专利技术将途径中的核心基因在野生型解脂耶氏酵母W29中进行了单因素过表达测试，可以显著增加菌株在甲酸盐培养基中的生物量，增幅为10%‑50%。由于该途径是完整的自催化循环，净反应为将一分子甲酸和一分子二氧化碳或碳酸氢盐转化为一分子甘氨酸，因此这条路线可用于生产甘氨酸及其衍生产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学和基因工程领域，具体涉及一种甲酸利用的解脂耶氏酵母及其制备方法。
技术介绍
1、甲酸和甲醇均被誉为“液态阳光”，可由二氧化碳电化学还原制备。相比于甲醇的可燃性，甲酸及其盐类则更加安全、易存储。并且，甲酸同化菌株，可以避免甲醇营养型菌株的有毒中间体——甲醛的强毒性。因此，设计和挖掘高效的甲酸生物利用技术路线，并将其应用于开发能够利用甲酸的菌株中合成目标产品，具有明确低碳属性和重要应用前景。
2、目前，甲酸营养型菌株主要分为两类，天然具有甲酸同化路线的甲基营养菌和工程化的甲酸同化菌株。将天然菌中的甲酸同化元件和路线整合在大肠杆菌、假单胞菌和酿酒酵母等易于编辑和生长迅速的菌株中构建而来的合成甲基营养型菌株日益增多，是甲基营养型菌株最主要的获得手段。但甲酸同化路线非常稀少，主要为天然的还原甘氨酸途径，天然的丝氨酸循环，人工修正的丝氨酸循环，以及厌氧条件下利用乙酰辅酶a同化甲酸生成丙酮酸的过程。糖酵解，三羧酸循环和磷酸戊糖途径在糖类底物利用中是公认的中心代谢途径，前两者代谢流分布尤其占主导地位。但随细胞所处环境和生长阶段的不同，也存在一定的差异甚至是相反的结果。如在甲醇营养菌中，因底物摄入方式发生变化，磷酸戊糖途径往往更为主导，细胞需要逆行再生葡萄糖作为细胞壁等组分，tca循环也可能因能量的需求变化部分被绕行。因此，在甲酸利用的菌株中，中心代谢的类型很可能也存在与传统糖类代谢过程截然迥异的过程。如何在细胞错综复杂的网络中呈现这些特异性的主干路线并加以利用，对于双碳目标下的低碳生物制造进程具有重要意义。</p>3、专利申请cn117363499a中公开了一种使用工业废水、乙酸钠、甲酸钠培养解脂耶氏酵母生产单细胞蛋白的方法，其中甲酸钠仅作为培养基的一个含量很低的组分（0.5-2g/l），仅达到了对甲酸盐很有限的利用能力并且未提升菌株对甲酸盐的耐受性。专利申请cn116622612a公开了一种采用等离子诱变技术获得甲酸盐耐受型酿酒酵母的方法，该方法致死率高，且对存活菌株的表型潜在影响难以评估，形成的菌株在后续拓展应用过程中存在很大的缺陷风险。专利申请cn115521880a中公开了一种构建转基因甲酸营养型酵母的方法，这种方法通过在酵母中引入外源基因实现，限制了菌株在单细胞蛋白、单细胞油脂等领域的应用。并且，上述方法均仅提供了获取菌株的方法，并未提供可以迁移应用的新工具、新路线和新的酶元件，可拓展性和复用性大大降低。
技术实现思路
1、本专利技术通过高效、快速获得甲酸营养型解脂耶氏酵母的方法，摆脱菌株对于葡萄糖、木糖等糖类碳源的依赖，最大限度地塑造菌株的甲基营养型属性的同时，又能积累足够量用于持续进化的菌株群体，高效、快速地获得可耐受高浓度甲酸、并以甲酸为主要或唯一碳源的甲基营养型解脂耶氏酵母，并将其作为单细胞蛋白、单细胞油脂和工程化甲酸基产品的基础合成底盘。同时，通过对菌株的代谢基础进行解析，获得具有功能的核心酶元件和代谢路线，以应用于提升菌株的甲酸利用能力及其衍生的生物基产品合成能力。最终研发完成本专利技术。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术还提供一种甲酸利用的解脂耶氏酵母，其是基于甲酸盐培养条件下，由乙醛酸驱动的丝氨酸合成循环gser循环和苏氨酸驱动的丝氨酸循环tser循环中一个或多个环节涉及的催化酶的编码基因在所述解脂耶氏酵母中进行过表达而得到：
4、其中，gser循环的环节如下：1）甲酸经三功能的四氢叶酸甲酰化酶/亚甲基-四氢叶酸脱氢酶/亚甲基四氢叶酸环水解酶催化形成5，10-亚甲基四氢叶酸，2）5，10-亚甲基四氢叶酸与甘氨酸由丝氨酸羟甲基转移酶催化生成丝氨酸，3）丝氨酸经丝氨酸脱氨酶催化为丙酮酸，4）丙酮酸经丙酮酸羧化酶催化固定二氧化碳形成草酰乙酸，6）草酰乙酸和乙酰辅酶a在柠檬酸合酶催化下生成柠檬酸，7）柠檬酸经顺乌头酸合酶转化为异柠檬酸后，在异柠檬酸裂合酶作用下分解为乙醛酸和琥珀酸，8）乙醛酸在丙氨酸-乙醛酸转氨酶作用下形成甘氨酸，9）琥珀酸则通过琥珀酸脱氢酶，富马酸水合酶和苹果酸脱氢酶催化的级联反应再生回草酰乙酸；tser循环的环节：1）甲酸经三功能的四氢叶酸甲酰化酶/亚甲基-四氢叶酸脱氢酶/亚甲基四氢叶酸环水解酶催化形成5，10-亚甲基四氢叶酸，2）5，10-亚甲基四氢叶酸与甘氨酸由丝氨酸羟甲基转移酶催化生成丝氨酸，3）丝氨酸经丝氨酸脱氨酶催化转化为丙酮酸，4）丙酮酸经丙酮酸羧化酶催化形成草酰乙酸，5）草酰乙酸可以经谷草转氨酶，天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，高苏氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶的级联催化转化为苏氨酸，6）苏氨酸经苏氨酸醛缩酶作用分解为乙醛和甘氨酸，7）乙醛经乙酰-coa合成酶或者双功能的乙酰-coa水解酶/琥珀酰-coa:乙酸-coa转移酶催化转化为乙酰辅酶a。
5、优选地，过表达如下编码基因及其同工酶中的一种或多种：三功能的四氢叶酸甲酰化酶/亚甲基-四氢叶酸脱氢酶/亚甲基四氢叶酸环水解酶、甲酸脱氢酶-1、乙酰-coa水解酶/琥珀酰-coa:乙酸-coa转移酶、乙醛脱氢酶-3、丙氨酸-乙醛酸转氨酶、异柠檬酸裂合酶-1、异柠檬酸裂合酶-2、苏氨酸醛缩酶、丙酮酸羧化酶、丝氨酸脱氨酶-1和丝氨酸脱氨酶-2。
6、具体地，所述过表达是通过携带编码基因的表达质粒导入解脂耶氏酵母中实现，具体的质粒中含有pgpd1启动子和tpex20终止子的质粒pcq28作为出发质粒。
7、更具体地，所述编码基因是来源于解脂耶氏酵母。
8、本专利技术提供所述的解脂耶氏酵母在合成甘氨酸或其衍生产品中的应用。
9、进一步地，所述衍生产品是丝氨酸，甲基化甘氨酸，甜菜碱和草甘膦中的一种或多种。
10、具体地，合成甘氨酸或其衍生产品所需的原料为甲酸，二氧化碳或碳酸氢盐。更具体地，应用时培养所述解脂耶氏酵母以甲酸为主要或唯一碳源。
11、本专利技术对实验室驯化的耐受高浓度甲酸盐的野生型解脂耶氏酵母进行了转录组测序，通过代谢网络模型预测的通量分布数据辅助转录组学分析后，发现了一条来自于解脂耶氏酵母菌株内源的甲酸代谢途径，gser-tser双循环（依赖于乙醛酸和苏氨酸驱动的丝氨酸双循环途径）。本专利技术将途径中的14个核心基因在野生型解脂耶氏酵母w29中进行了单因素过表达测试，其中绝大部分（11/14）可以显著增加菌株在甲酸盐培养基中的生物量，增幅为10%-50%。由于该途径是完整的自催化循环，净反应为将一分子甲酸和一分子二氧化碳（或碳酸氢盐）转化为一分子甘氨酸，因此这条路线可用于生产甘氨酸及其衍生产品。
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【技术保护点】
1.一种甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，其是基于甲酸盐培养条件下，由乙醛酸驱动的丝氨酸合成循环gSer循环和苏氨酸驱动的丝氨酸循环tSer循环中一个或多个环节涉及的催化酶的编码基因在所述解脂耶氏酵母中进行过表达而得到：
2.如权利要求1所述的甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，过表达如下编码基因及其同工酶中的一种或多种：三功能的四氢叶酸甲酰化酶/亚甲基-四氢叶酸脱氢酶/亚甲基四氢叶酸环水解酶、甲酸脱氢酶-1、乙酰-CoA水解酶/琥珀酰-CoA:乙酸-CoA转移酶、乙醛脱氢酶-3、丙氨酸-乙醛酸转氨酶、异柠檬酸裂合酶-1、异柠檬酸裂合酶-2、苏氨酸醛缩酶、丙酮酸羧化酶、丝氨酸脱氨酶-1和丝氨酸脱氨酶-2。
3.如权利要求1所述的甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，所述过表达是通过携带编码基因的表达质粒导入解脂耶氏酵母中实现。
4.如权利要求3所述的甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，所述表达质粒是含有PGPD1启动子和TPEX20终止子的质粒pCQ28。
5.如权利要求2所述的甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，所述编码基因是来源于解脂耶氏酵母。
6.如权利要求1至5任一项所述的解脂耶氏酵母在合成甘氨酸或其衍生产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述衍生产品是丝氨酸，甲基化甘氨酸，甜菜碱和草甘膦中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，合成甘氨酸或其衍生产品所需的原料为甲酸，二氧化碳或碳酸氢盐。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，应用时培养所述解脂耶氏酵母以甲酸为主要或唯一碳源。
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【技术特征摘要】
1.一种甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，其是基于甲酸盐培养条件下，由乙醛酸驱动的丝氨酸合成循环gser循环和苏氨酸驱动的丝氨酸循环tser循环中一个或多个环节涉及的催化酶的编码基因在所述解脂耶氏酵母中进行过表达而得到：
2.如权利要求1所述的甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，过表达如下编码基因及其同工酶中的一种或多种：三功能的四氢叶酸甲酰化酶/亚甲基-四氢叶酸脱氢酶/亚甲基四氢叶酸环水解酶、甲酸脱氢酶-1、乙酰-coa水解酶/琥珀酰-coa:乙酸-coa转移酶、乙醛脱氢酶-3、丙氨酸-乙醛酸转氨酶、异柠檬酸裂合酶-1、异柠檬酸裂合酶-2、苏氨酸醛缩酶、丙酮酸羧化酶、丝氨酸脱氨酶-1和丝氨酸脱氨酶-2。
3.如权利要求1所述的甲酸利用的解脂耶氏酵母，其特征在于，所述过表达是通过携带编...
【专利技术属性】
技术研发人员：张燕飞，杨雪，陈倩，马雨悦，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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