一种利用甾体化合物诱导抗性基因表达的大肠杆菌质粒及其应用制造技术

技术编号：41065420 阅读：12 留言：0更新日期：2024-04-24 11:19

本发明专利技术提供一种甾体诱导抗性基因表达的大肠杆菌质粒及其应用。所述质粒以pLysS为基础进行改造，整合了teiR、hsdR、repA三种转录因子和受它们调控表达的tcR共计四个基因的操纵子序列，构建成单一的质粒pDERNHT。该质粒转化大肠杆菌可用于检测甾体类物质的浓度。将该质粒与甾体代谢酶表达质粒共转入大肠杆菌，可以实现对甾体代谢酶的活性筛选。本发明专利技术通过将甾体代谢酶活性与四环素抗性耦联，进而与菌体繁殖速度耦联，从而实现对甾体浓度的检测；进一步的，可以利用菌体之间的生存竞争，实现对甾体代谢酶活性的大规模自动化筛选，具有高通量、低仪器依赖的优点。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、微生物学和生物，具体涉及一种利用甾体化合物诱导抗性基因表达的大肠杆菌质粒及利用该质粒实现的基于菌体生长速度快速检测甾体代谢产物的方法。

技术介绍

1、甾体类物质具有广泛的应用前景，目前甾体类物质通常需要借助lc-ms/lc-uv/gc-ms等仪器进行分离、检测，甾体代谢酶的活性测定通常需要通过转化菌株、分离单菌落、蛋白表达与分离纯化、酶催化反应/全细胞催化、产物萃取、lc/gc检测等一系列过程，检测步骤复杂，通量低、耗时长。

2、目前已有的检测甾体类物质浓度的生物传感器有两种，均为利用睾丸酮丛毛单胞菌3α-羟基甾体脱氢酶（3α-hsd，相应基因为 hsda）的调控机制构建。其一，将 hsda启动子与绿色荧光蛋白gfp基因构建为操纵子，整合入睾丸酮丛毛单胞菌基因组中（maser e, xiongg. the comamonastestosteroni steroid biosensor system (coss)--reflection onother methods. j steroid biochemmol biol. 2010;121(3-5):633-40.）；其二，为中国专利cn102147364，构建了两个质粒，分别包含3α-hsd及其上下游调控因子、 hsda启动子与绿色荧光蛋白gfp基因构建的操纵子。这两种方法均存在诱导荧光强度弱、甾体化合物易降解、应用面狭窄等缺点。

技术实现思路

1、本专利技术旨在开发一种新型的甾体生物传感器，要求其具有微弱的甾体代谢速率和简便的检测机制，从而拓展这种生物传感器的应用范围。具体为开发一种以大肠杆菌为宿主的甾体诱导表达体系，基于甾体化合物诱导表达，实现甾体代谢酶活性与四环素抗性的耦联，进一步实现基于菌体生长速率快速检测甾体代谢产物。此外，本专利技术涉及的质粒可应用于甾体代谢酶的大规模初筛，从而显著提升甾体代谢酶的筛选效率，并使得易错pcr等原本因筛选规模过大难以实施的定向进化酶优化方法得以有效使用。

2、本专利技术提供一种甾体生物传感器，其特征在于，含有 teir、hsdr、repa三种转录因子和受它们调控表达的 tcr共计四个基因的操纵子序列的宿主菌，其所述四个操纵子序列构建而成的单一质粒，或分别构建在不同质粒上，或者一个或多个操纵子序列整合到宿主菌的基因组中，优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

3、具体地，包括 hsdr操纵子: hsdr基因的启动子， hsdr基因cds序列、第一终止子序列； repa操纵子: lac启动子、laco操纵序列、 repa基因cds序列、第二终止子序列； teir操纵子:lacuv5启动子、 teir基因cds序列、第三终止子；以及 hsda的5’调控序列和四环素抗性基因 tcr的cds序列及第四终止子序列；任选地，进一步包括抗性基因如氯霉素抗性基因 cmr操纵子和复制起始位点。

4、更优选地， hsdr操纵子包括 hsdr基因的野生型启动子， hsdr基因cds序列，phea-1终止子序列；具体地， hsdr基因的野生型启动子如seq id no.1所示第7-95位的核苷酸序列， hsdr基因cds如seq id no.1所示100-1020bp的核苷酸序列，phea-1终止子如seq idno.1所示第1033-1064bp的核苷酸序列；更具体的，其核苷酸序列如seq id no.1所示第1至1064位bp所示。

5、另外优选地， repa操纵子序列包括lac启动子、laco操纵序列、 repa基因cds序列和三串联终止子序列；具体地，lac启动子如seq id no.1的1139-1167bp所示核苷酸序列，laco操纵序列如seq id no.1的1175-1191bp所示核苷酸序列， repa基因cds如seq id no.1的1261-2070bp所示核苷酸序列，所述三串联终止子序列包括rrnb t1终止子、rrnb t2终止子和t7终止子，优选地rrnb t1终止子如seq id no.1的第2459-2545bp所示核苷酸序列、rrnb t2终止子如seq id no.1的第2637-2664bp所示核苷酸序列如seq id no.1的第2767-2814bp所示核苷酸序列；更具体地， repa操纵子如seq id no.1的第1139-2814bp所示核苷酸序列，

6、进一步优选地，所述 teir操纵子包括lacuv5启动子如seq id no.1的第5674-5704bp所示核苷酸序列， teir基因cds序列如seq id no.1的第5758-6933bp所示核苷酸序列，终止子如seq id no.1的6951-6979bp所示核苷酸序列。

7、在具体实施方式中， hsda的5’调控序列如seq id no.1的第2842-3015bp所示核苷酸序列，repa蛋白的两个结合位点如seq id no.1的第3005-3014bp所示核苷酸序列，hsdr蛋白结合位点如seq id no.1的第2960-2972bp所示核苷酸序列， hsda启动子如seq idno.1的第2980-3015bp所示核苷酸序列；四环素抗性基因 tcr的cds序列如seq id no.1的第3052-4242bp所示核苷酸序列。

8、在优选实施方式中，plyss的氯霉素抗性基因 cmr操纵子和其复制起点，具体的plyss的氯霉素抗性基因 cmr操纵子如seq id no.1的第4607-5369bp所示核苷酸序列，复制起始位点为p15a ori，具体为如seq id no.1的第7007-7552bp所示核苷酸序列。

9、具体实施方式中，其中四个操纵子序列构建为单本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种甾体生物传感器，其特征在于，含有teiR、hsdR、repA三种转录因子和受它们调控表达的tcR共计四个基因的操纵子序列的宿主菌，其所述四个操纵子序列构建在单一质粒上，或分别构建在不同质粒上，或者一个或多个操纵子序列整合到宿主菌的基因组中，优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的甾体生物传感器，其特征在于，具体包括hsdR操纵子：hsdR基因的启动子，hsdR基因CDS序列、第一终止子序列；repA操纵子：ac启动子、lacO操纵序列、repA基因CDS序列、第二终止子序列；teiR操纵子：lacUV5启动子、teiR基因CDS序列、第三终止子序列；以及hsdA的5’调控序列、四环素抗性基因tcR的CDS序列及第四终止子序列；任选地，进一步包括抗性基因如氯霉素抗性基因cmR操纵子和复制起始位点；优选地，hsdR操纵子包括hsdR基因的野生型启动子，hsdR基因CDS序列，pheA-1终止子序列；具体地，hsdR基因的野生型启动子如SEQ ID No.1所示第7-95位的核苷酸序列，hsdR基因CDS如SEQ ID No.1所示100-1020bp

3.如权利要求1所述的甾体生物传感器，其特征在于，所述teiR操纵子包括lacUV5启动子如SEQ ID No.1的第5674-5704bp所示核苷酸序列，teiR基因CDS序列如SEQ ID No.1的第5758-6933bp所示核苷酸序列，终止子如SEQ ID No.1的6951-6979bp所示核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的甾体生物传感器，其特征在于，hsdA的5’调控序列如SEQ IDNo.1的第2842-3015bp所示核苷酸序列，RepA蛋白的两个结合位点如SEQ ID No.1的第3005-3014bp所示核苷酸序列，HsdR蛋白结合位点如SEQ ID No.1的第2960-2972bp所示核苷酸序列，hsdA启动子如SEQ ID No.1的第2980-3015bp所示核苷酸序列；四环素抗性基因TcR的CDS序列如SEQ ID No.1的第3052-4242bp所示核苷酸序列。

5.如权利要求2所述的甾体生物传感器，其特征在于，pLysS的氯霉素抗性基因cmR操纵子和其复制起点，具体的pLysS的氯霉素抗性基因cmR操纵子如SEQ ID No.1的第4607-5369bp所示核苷酸序列，复制起始位点为p15A ori，具体为如SEQ ID No.1的第7007-7552bp所示核苷酸序列。

6.如权利要求2所述的甾体生物传感器，其特征在于，其中四个操纵子序列构建为单一质粒，优选地，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；或者为两个或三个或四个质粒组合，其中质粒分别含四个操纵子序列一个或两个或三个。

7.如权利要求1至6任一项所述的生物传感器在甾体代谢酶活性筛选中的应用。

8.一种甾体代谢酶活性筛选的方法，其特征在于，将如权利要求1至6任一项所述的生物传感器导入含有不同抗性基因且与pLysS相容的甾体代谢酶表达质粒，并进行培养，其中培养基中含有四环素、氯霉素和该质粒的抗生素，并添加甾体代谢酶所催化的底物，通过大肠杆菌繁殖速度来对甾体代谢酶的活性筛选；优选地，所述甾体代谢酶选自甾体合成酶，甾体17，20-裂解酶，雌酮合酶，相应底物为环氧角鲨烯、植物甾醇、雄烯二酮；

9.权利要求1至6任一项所述的生物传感器在甾体浓度检测中的应用，其特征在于，在四环素条件下，检测转化菌株在不同浓度睾酮条件下和样品条件下的菌体生长速率，从而估算样...

【技术特征摘要】

1.一种甾体生物传感器，其特征在于，含有teir、hsdr、repa三种转录因子和受它们调控表达的tcr共计四个基因的操纵子序列的宿主菌，其所述四个操纵子序列构建在单一质粒上，或分别构建在不同质粒上，或者一个或多个操纵子序列整合到宿主菌的基因组中，优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的甾体生物传感器，其特征在于，具体包括hsdr操纵子：hsdr基因的启动子，hsdr基因cds序列、第一终止子序列；repa操纵子：ac启动子、laco操纵序列、repa基因cds序列、第二终止子序列；teir操纵子：lacuv5启动子、teir基因cds序列、第三终止子序列；以及hsda的5’调控序列、四环素抗性基因tcr的cds序列及第四终止子序列；任选地，进一步包括抗性基因如氯霉素抗性基因cmr操纵子和复制起始位点；优选地，hsdr操纵子包括hsdr基因的野生型启动子，hsdr基因cds序列，phea-1终止子序列；具体地，hsdr基因的野生型启动子如seq id no.1所示第7-95位的核苷酸序列，hsdr基因cds如seq id no.1所示100-1020bp的核苷酸序列，phea-1终止子如seq id no.1所示第1033-1064bp的核苷酸序列；更具体的，其核苷酸序列如seq id no.1所示第1至1064位bp所示；另外优选地，repa操纵子序列包括lac启动子、laco操纵序列、repa基因cds序列和三串联终止子序列；具体地，lac启动子如seq id no.1的1139-1167bp所示核苷酸序列，laco操纵序列如seq id no.1的1175-1191bp所示核苷酸序列，repa基因cds如seq id no.1的1261-2070bp所示核苷酸序列，所述三串联终止子序列包括rrnb t1终止子、rrnb t2终止子和t7终止子，优选地rrnbt1终止子如seq id no.1的第2459-2545bp所示核苷酸序列、rrnb t2终止子如seq id no.1的第2637-2664bp所示核苷酸序列如seq id no.1的第2767-2814bp所示核苷酸序列；更具体地，repa操纵子如seq id no.1的第1139-2814bp所示核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的甾体生物传感器，其特征在于，所述teir操纵子包括lacuv5启动子如seq id no.1的第5674-5704bp所示核苷酸序列，t...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志曦，朱敦明，冯进辉，王玉，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：

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