一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。所述方法为将大米蛋白前处理充分溶解后；利用糜蛋白酶和链霉蛋白酶分步酶解大米蛋白，D101大孔吸附树脂吸附酶解液中的游离苯丙氨酸，以脱除大米蛋白中的苯丙氨酸。本发明专利技术大量客观实验对酶解条件和吸附条件进行多因素优化，最终确定了能够脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。本发明专利技术所述的方法快速高效、操作简单、条件温和。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白中苯丙氨酸可由4.72％降低至0.29％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。
技术介绍
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)或称苯丙氨酸羟化酶缺乏症(phenylalanine hydroxylase deficiency)是一种常染色体隐性遗传疾病。它是由于体内无法正常代谢苯丙氨酸而导致中枢神经系统的永久性损伤。只要在新生儿期获得诊断和给予及时的低苯丙氨酸饮食，可避免患儿的智力损害。食疗法是治疗苯丙酮尿症一种公认的，长期坚持具有显著效果的方法，即控制患儿食物中苯丙氨酸摄入量以达到机体代谢平衡的一种方法。目前低苯丙氨酸产品主要有酶解吸附法、配方法、基因法。但究其根本是将苯丙氨酸进行高效脱除，苯丙氨酸的脱除现主要有酶解与吸附结合、酶解与超滤结合两种，Cabrera-Padilla等采用酶解与超滤结合的方法，首先用糜蛋白酶和羧肽酶-A酶解乳清蛋白，酶解时间18h，酶解后水解物经截流量为10KD的滤膜进行超滤，苯丙氨酸含量降至0.19％；可以看出，采用酶解与超滤结合的方法可以将苯丙氨酸有效脱除，但低于10KD的物质多为小分子肽、氨基酸等活性物质，这造成了营养浪费，在实际生产中不宜推广。周志伟等采用酶解与吸附结合的方法，一种经纯化的粗制微生物蛋白酶作用于酪蛋白，蛋白水解物通过选择性吸附，其苯丙氨酸含量由4.8％降至0.5％；由此可见，采用超滤脱除苯丙氨酸的方法高于吸附脱除，但在低苯丙氨酸蛋白的制备中，应尽可能多的保留天然蛋白中的营养素。采用酶解与吸附结合的方法可较大程度的保留天然蛋白中的营养物质，且工业生产中易于实现。因此，利用酶解与吸附结合的方法脱除苯丙氨酸的研究至关重要，现存在的苯丙氨酸脱除方法耗时长，步骤繁琐，产生的经济效益低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，该方法简单、条件温和、快速有效的脱除大米蛋白中苯丙氨酸，制备针对苯丙酮尿症患者的特膳饮食作基料。本专利技术所述的方法快速高效、操作简单、条件温和。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白中苯丙氨酸可由4.72％降低至0.29％。本专利技术技术方案如下：一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：将大米蛋白充分溶解，制得大米蛋白溶解液，加入糜蛋白酶进行酶解，得到酶解液I；再加入链霉蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液II；使(所述酶解液II中的)糜蛋白酶和链霉蛋白酶失活，离心取上清液(即得大米蛋白酶解液III)；用D101大孔吸附树脂吸附，收集洗脱液(即吸附后的溶液)，即为脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液。上述脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，其中，所述大米蛋白的蛋白质含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量≥4.72％。所述大米蛋白溶解液的质量浓度为1-2％，优选质量浓度为1％。所述糜蛋白酶的加入量为4800-14400U/g蛋白，优选为4800-9600U/g蛋白，进一步优选为7200U/g蛋白；所述酶解的条件为：酶解温度：40-60℃，优选为45-55℃，更优选50-55℃；酶解时间：4-12h，优选6-10h，进一步优选为6-8h。所述酶解优选在恒温水浴振荡器中进行。优选地，所述糜蛋白酶的酶活≥1.20×106U/g。所述链霉蛋白酶的加入量50-146U/g蛋白，优选为74-122U/g蛋白，进一步优选为98U/g蛋白；所述酶解的条件为：酶解温度：30-50℃，优选为35-45℃，更优选35-40℃；酶解时间：1-5h，优选2-4h，进一步优选为3h。所述酶解优选在恒温水浴振荡器中进行。优选地，所述链霉蛋白酶的酶活≥7.00×103U/g。所述使糜蛋白酶和链霉蛋白酶灭活的方法包括：将所述酶解液II升温至90-95℃，保持10-20min。所述离心的条件为：转速4000-4500rpm，时间20-30min。所述吸附速度为10-50r/min，优选为20-40r/min，进一步优选为20-30r/min。具体地，所述脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：将蛋白质含量≥75％、脂肪含量≤1％、苯丙氨酸含量≥4.72％的大米蛋白充分溶解，制得质量浓度为1-2％的大米蛋白溶解液，按照4800-9600U/g蛋白的用量加入糜蛋白酶进行酶解6-8h，酶解温度50-55℃，得到酶解液I；再按照74-122U/g蛋白的用量加入链霉蛋白酶，继续进行酶解，酶解温度35-45℃，得到酶解液II；使(所述酶解液II中的)糜蛋白酶和链霉蛋白酶失活，离心取上清液(即得大米蛋白酶解液III)；用D101大孔吸附树脂吸附，吸附速度为20-40r/min，收集洗脱液(即吸附后的溶液)，即为脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液。上述脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，进一步地还包括将所述洗脱液(即吸附后的溶液，脱除苯丙氨酸的大米蛋白溶液)进行干燥的步骤；优选为冷冻干燥。如无特殊指明，本专利技术所述的糜蛋白酶是指牛或猪胰中提取的一种蛋白分解酶，用于肽链的酶解，专门水解肽键，属于肽链内切酶，水解产率很高。所述糜蛋白酶可按现有技术方法制备，也可外购商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：C8660，酶活为1.20×106U/g。如无特殊指明，本专利技术所述链霉蛋白酶是自灰色链霉菌中分离的非特异性蛋白水解酶；所链霉蛋白酶可按现有技术方法制备，也可外购商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：P8360，酶活为7.00×103U/g。本专利技术对糜蛋白酶酶活的定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。本专利技术对链霉蛋白酶酶活定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。本专利技术还包括按上述方法制备的脱除苯丙氨酸的大米蛋白；优选地，所述大米蛋白中苯丙氨酸含量≤0.29％。本专利技术所述方法可特异性吸附苯丙氨酸，对其他氨基酸含量损失较小，也可有效保留天然蛋白中的其他营养成分。如无特殊指明，本专利技术所述大米蛋白中苯丙氨酸均为总苯丙氨酸。本专利技术通过大量客观实验对酶解条件和吸附条件进行多因素优化，最终确定了能够脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。本专利技术所述的方法快速高效、操作简单、条件温和。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白中苯丙氨酸可由4.72％降低至0.29％。附图说明图1表示实验例1糜蛋白酶不同酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响；图2表示实验例2糜蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响；图3表示实验例3糜蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响；图4表示表示实验例4链霉蛋白酶酶解时间对苯丙氨酸游离效果的影响；图5表示实验例5链霉蛋白酶加入量对苯丙氨酸游离效果的影响；图6表示实验例6链霉蛋白酶酶解温度对苯丙氨酸游离效果的影响；图7表示实验例7吸附条件对苯丙氨酸脱除效果的影响。图1-6中，纵坐标均指游离苯丙氨酸浓质量度；图7中纵坐标Phe content指总苯丙氨酸浓质量度，Time指吸附时间；横坐标Speed指流速。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。下述实施例中所采用的糜蛋白酶购本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：将大米蛋白充分溶解，制得大米蛋白溶解液，加入糜蛋白酶进行酶解，得到酶解液I；再加入链霉蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液II；使糜蛋白酶和链霉蛋白酶失活，离心取上清液；用D101大孔吸附树脂吸附，收集洗脱液。

【技术特征摘要】
1.一种脱除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：将大米蛋白充分溶解，制得大米蛋白溶解液，加入糜蛋白酶进行酶解，得到酶解液I；再加入链霉蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液II；使糜蛋白酶和链霉蛋白酶失活，离心取上清液；用D101大孔吸附树脂吸附，收集洗脱液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大米蛋白的蛋白质含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量≥4.72％。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大米蛋白溶解液的质量浓度为1-2％，优选为1％。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述糜蛋白酶的加入量为4800-14400U/g蛋白，优选为4800-9600U/g蛋白，进一步优选为7200U/g蛋白；所述酶解的条件为：酶解温度：40-60℃，优选为45-55℃，更优选50-55℃；酶解时间：4-12h，优选6-10h，进一步优选为6-8h。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述链霉蛋白酶的加入量50-146U/g蛋白，优选为74-122U/g蛋白，进一步优选为98U/g蛋白；所述酶解的条件为：酶解温度：30-50℃，优选为35-45℃，更优选35-40℃；酶解时间：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红芝，王强，盛晓静，石爱民，刘丽，胡晖，杨颖，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11