异源代谢途径生产苯酚的方法及其应用技术

异源代谢途径生产苯酚的方法及其应用属于生物合成苯酚领域。所述产苯酚的微生物中导入了生产苯酚的代谢途径。更确切的说，是在大肠杆菌中高效表达了异分支酸合成酶(isochorismate synthase)，异分支酸-丙酮酸裂解酶(isochorismate pyruvate lyase)和水杨酸脱羧酶(salicylate decarboxylase)。这些酶所编码的基因构建在带有Lac启动子，含有抗生素抗性的表达质粒上。将构建好的质粒导入大肠杆菌中，结果得到了可以利用葡萄糖生产苯酚的生产菌株，通过增加通路中的碳源，使本发明专利技术的苯酚生产方法更为有效，选用一株苯丙氨酸高产菌株的衍生菌作为宿主菌，更有利于苯酚的生产。

Method for producing phenol by using different metabolic pathway and application thereof

Method for producing phenol by heterologous metabolic pathway and application thereof. Metabolic pathways for the production of phenol are introduced into the phenol producing microorganisms. More precisely, it is highly expressed in E. coli isochorismate synthase (isochorismate synthase), isochorismate pyruvate lyase (isochorismate pyruvate lyase) and salicylic acid decarboxylase (salicylate decarboxylase). The genes encoded by these enzymes were constructed on the expression plasmid containing Lac promoter and antibiotic resistance. The constructed plasmid was transformed into Escherichia coli. The results obtained can be used to produce glucose phenol production strains, by increasing the pathway of carbon source in the production of phenol, the method of the invention is more effective, with a strain of high yield strains of bacteria derived phenylalanine as host bacteria, more conducive to the production of phenol.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，更确切的说，本专利技术涉及异源生物合成苯酚的代谢途径，通过增强碳通量，选用苯丙氨酸高产菌株的衍生菌作为宿主细胞，最终提高了苯酚的产量，实现苯酚的清洁生产。
技术介绍
苯酚又称石炭酸，是一种重要的苯系中间体，作为一种大宗化学品，具有广泛的应用。它主要用作聚碳酸酯、环氧树脂和酚醛树脂的合成前体。此外，还可用于合成除草剂和药物。在2008年，全球生产的苯酚超过八百万吨。目前，生产苯酚的主要途径是以苯为原料，用异丙苯法生产苯酚。此方法首先是将丙烯与苯在三氯化铝的催化作用下生成异丙苯，接着异丙苯被氧化生成过氧化异丙苯，之后再用硫酸分解，就可以得到苯酚，此方法具有不可再生性，而且对环境污染较严重。随着人们对石油危机和环境污染问题的关注，人们越来越重视开发新的可持续生产工艺，用于生产苯酚和其他化学衍生产品。代谢工程是一种很有前途的替代品，并已实现了许多以可再生资源为原料的各种化学品的生物生产。目前，已经有几个研究小组报道过苯酚的生产途径，J.Wery等人在恶臭假单胞菌S12中构建了苯酚生物合成途径。通过导入一个外源的酪氨酸苯酚裂解酶(TPL)，可以实现酪氨酸到苯酚的转化。为了增加苯酚合成路径中前体的供应，作者增强了莽草酸途径中3-deoxy-d-arabino-heptolosonate-7-phosphate(DAHP)合成酶的表达。在摇瓶培养中，最终可以产生142mg/L的苯酚。同时作者又以正辛醇为萃取剂进行了双相培养，苯酚的产量进一步提高到868mg/L。Kim等人将上述的途径构建在大肠杆菌中，为了提高酪氨酸的供应，用小RNA下调了csrA和tyrR的表达，摇瓶实验数据显示，工程菌可以从葡萄糖开始产419mg/L的苯酚。同时以三丁酸甘油酯作为萃取剂进行双相培养，苯酚的产量可以提高到3.79g/L。最近，L.Miao等人通过引入4-羟基苯甲酸脱羧酶，在大肠杆菌中构建了一种新的苯酚生产途径。4-羟基苯甲酸是大肠杆菌中的天然代谢产物，是丙酮酸裂解酶(ubiC)催化分支酸的产物。作者将途径中的基因整合到染色体中，获得基因稳定的菌株。通过调节基因的表达水平，摇瓶培养苯酚的产量可以达到250mg/L。接着利用五种不同的溶剂进行双相萃取发酵，研究表明邻苯二甲酸二丁酯是提高苯酚产量的最好萃取剂。在7L发酵罐中进行发酵，苯酚的产量可以达到9.51g/L。本实验中，我们通过连接水杨酸合成路径和脱羧路径设计了一个新的苯酚生物合成途径。通过对路径和菌株的优化，最终摇瓶实验生产苯酚达到472.13mg/L。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了生产苯酚的微生物，通过向微生物中导入三种不同功能的基因，构建异源生物合成苯酚的新路径。本专利技术的另一个目的是提供所述产苯酚的微生物的发酵生产方法。本专利技术的又一目的是通过增强路径中的碳通量，导入相应的质粒，实现微生物高产苯酚。本专利技术的再一目的是选用一株苯丙氨酸高产菌株的衍生菌，进一步提高微生物生产苯酚的方法。异源代谢途径生产苯酚的方法，其特征在于：所述方法包括分支酸到水杨酸的生物合成以及水杨酸到苯酚的生物合成，其中，所述分支酸到水杨酸的生物合成路径中涉及到异分支酸合成酶和异分支酸丙酮酸裂解酶,即分支酸在异分支酸合成酶的催化作用下生成异分支酸，之后异分支酸在异分支酸丙酮酸裂解酶的催化作用下生成水杨酸；在其中所述水杨酸到苯酚的生物合成路径涉及到水杨酸脱羧酶，即水杨酸在水杨酸脱羧酶的作用下生成苯酚。能够完成分支酸到水杨酸的生物合成路径的微生物基因表达元件为下述1)或2)中的一种:1)由Lac启动子、氨苄青霉素抗性、编码异分支酸合成酶(isochorismatesynthase)的基因entC和编码异分支酸丙酮酸裂解酶(isochorismatepyruvatelyase)的基因pchB组成的100-150个拷贝数的质粒；2)由Lac启动子、卡那青霉素抗性、编码异分支酸合成酶(isochorismatesynthase)的基因entC和编码异分支酸丙酮酸裂解酶(isochorismatepyruvatelyase)的基因pchB组成的30-50个拷贝数的质粒。能够完成水杨酸到苯酚的生物合成路径的微生物的基因表达元件为下述1)或2)中的一种:1)由Lac启动子、氨苄青霉素抗性、编码水杨酸脱羧酶(salicylatedecarboxylase)的基因kpBDC组成的100-150个拷贝数的质粒；2)由Lac启动子、卡那青霉素抗性、编码水杨酸脱羧酶(salicylatedecarboxylase)的基因kpBDC组成的30-50个拷贝数的质粒。苯酚生产途径的宿主微生物选自于大肠杆菌BW25113、JM109或QH4。在大肠杆菌中导入了质粒pCS-APTA,该质粒上含有包括莽草酸途径中四个关键的基因：aroL,ppsA,tktA和aroGfbr。通过选用一株高产苯丙氨酸的菌株ATCC31884，敲除pheA和tyrA基因的QH4作为宿主菌进行发酵实验。菌株QH4作为宿主菌进行发酵实验，在M9Y培养基中培养产苯酚微生物，试管摇菌过夜，选用1％-2％的体积接种量，加入IPTG诱导，保证IPTG在体系里的终浓度为0.5mM，表达蛋白，选用30℃或37℃诱导温度，诱导时间为48小时。本专利技术还提供了微生物产苯酚的方法：第一种是体外添加水杨酸，向大肠杆菌BW25113中导入质粒pZE-kpBDC。将单菌落接种于3mlLB培养基中，内含有100μg/ml的氨苄青霉，37℃过夜培养。将过夜培养的菌液接种到含氨苄青霉素的50ml的M9Y培养基中。菌体在37℃的摇床中培养至OD600值为0.6时，加入0.25mM的IPTG进行诱导。之后分别在诱导后8小时，16小时，24小时和36小时的时候添加水杨酸(最终浓度为400mg/L)。从发酵液中取样，利用高效液相色谱对产物的浓度进行了分析；第二种是苯酚的从头合成，将产苯酚的菌株过夜培养之后，转接到含有抗生素的M9Y培养基中，37℃摇床摇3个小时后，向培养基中添加0.25mM的IPTG，30℃或37℃的条件下培养48h。诱导后每隔12h取样测OD,高效液相色谱测苯酚和水杨酸的浓度。本专利技术还提供了微生物高产苯酚的方法，具体有以下几种：第一是增加通路中的碳源，在菌株BP1中导入质粒pCS-APTA.。质粒pCS-APTA包括莽草酸途径中四个关键的基因(aroL,ppsA,tktA和aroGfbr)。对菌株进行摇瓶实验，苯酚的产量提高了将近一倍。第二是...

【技术保护点】
异源代谢途径生产苯酚的方法，其特征在于：所述方法包括分支酸到水杨酸的生物合成以及水杨酸到苯酚的生物合成，其中，所述分支酸到水杨酸的生物合成路径中涉及到异分支酸合成酶和异分支酸丙酮酸裂解酶,即分支酸在异分支酸合成酶的催化作用下生成异分支酸，之后异分支酸在异分支酸丙酮酸裂解酶的催化作用下生成水杨酸；在其中所述水杨酸到苯酚的生物合成路径涉及到水杨酸脱羧酶，即水杨酸在水杨酸脱羧酶的作用下生成苯酚。

【技术特征摘要】
1.异源代谢途径生产苯酚的方法，其特征在于：所述方法包括分支酸到水杨酸的生物
合成以及水杨酸到苯酚的生物合成，其中，所述分支酸到水杨酸的生物合成路径中涉及到
异分支酸合成酶和异分支酸丙酮酸裂解酶,即分支酸在异分支酸合成酶的催化作用下生成
异分支酸，之后异分支酸在异分支酸丙酮酸裂解酶的催化作用下生成水杨酸；在其中所述
水杨酸到苯酚的生物合成路径涉及到水杨酸脱羧酶，即水杨酸在水杨酸脱羧酶的作用下生
成苯酚。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：能够完成分支酸到水杨酸的生物合成路径
的微生物基因表达元件为下述1)或2)中的一种:
1)由Lac启动子、氨苄青霉素抗性、编码异分支酸合成酶(isochorismatesynthase)的
基因entC和编码异分支酸丙酮酸裂解酶(isochorismatepyruvatelyase)的基因pchB组
成的100-150个拷贝数的质粒；
2)由Lac启动子、卡那青霉素抗性、编码异分支酸合成酶(isochorismatesynthase)的
基因entC和编码异分支酸丙酮酸裂解酶(isochorismatepyruvatelyase)的基因pchB组
成的30-50个拷贝数的质粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：能够完成水杨酸到苯酚的生...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁其朋，孙新晓，任彦仙，杨森，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11