本发明专利技术公开了一种利用多菌种联合发酵生产苯丙氨酸的方法，包含的生产步骤有：混合培养基的制备、产氨短杆菌发酵、深红酵母发酵、苯丙氨酸放罐提纯。通过多菌种的联合发酵工艺发酵产生苯丙氨酸，解决了单菌种发酵酶活不高且在高氨高pH条件下容易失活的缺点。通过产氨短杆菌发酵尿素产生的氨作为氨源，再添加反式肉桂酸和深红酵母，在利于酵母发酵的低温条件下，通过酵母产生的苯丙氨酸解氨酶发酵反式肉桂酸和氨产生苯丙氨酸。发酵全程不添加氨水和碳酸氢铵，不造成环境污染，且产物后提取工艺较现有技术简单易行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵领域，尤其涉及利用多菌种联合发酵生产苯丙氨酸的方法。
技术介绍
苯丙氨酸在食品加工和医药、化妆品等行业均有应用。作为食品营养的强化剂和餐饮添加剂以及高甜保健型甜味剂阿斯巴甜（APM）的主要合成原料，特别是APM热量低，适于肥胖症人群及糖尿病患者食用，现在有多国获准销售。特别是其被证明有提神醒脑以及减肥等功效，还可以作为氨基酸类抗癌药物使用。目前苯丙氨酸的合成方法主要有四种：提取法、化学合成法、微生物发酵法、酶法，其中酶法又包括有苯丙酮酸酶法和肉桂酸酶法。目前国内大多数中小企业采用发酵法进行生产，但经过几年的生产，其缺陷逐渐暴露出来：产酸率低，生产周期较长，废水量大，能耗高等，加之国内肉桂酸价格也持续走低，达到1.8-2.0万元/吨，尤其广西肉桂酸资源较丰富，更增加了发酵法的可应用性。但是由于发酵法生产采用人工添加氨水及碳酸氢铵的方法提供氨源和高pH条件，造成了微生物生长受到制约，且微生物内部的苯丙氨酸解氨酶在很短的时间内就失活，严重制约了苯丙氨酸的发酵法生产，提供替换型氨源以及改善生产环境成为了迫切需求。现阶段很多学者试图通过基因工程手段，将微生物进行基因改造，用来发酵生产苯丙氨酸，如公开号CN102399835A的中国专利技术专利“一种微生物发酵生产L-苯丙氨酸的方法”，以及公开号CN102181503A的中国专利技术专利“一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法”都采用了基因工程手段，分别对谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌进行基因改造，用以发酵生产苯丙氨酸。但是通过基因改造的方法生产的苯丙氨酸产量较低，且存在潜在遗传风险，需要大量研究结果和实验数据支持才可以进入工业化生产，找到天然菌种进行苯丙氨酸生产也迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种多菌种联合发酵生产苯丙氨酸的方法。克服了现有技术人工添加氨水造成酶失活较快，以及基因改造存在潜在风险的缺点。本专利技术的目的是通过以下步骤来实现的：（1）混合培养基的制备：将大麦芽除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，以质量体积比为1:4（KG/L）的比例加入纯水，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀。使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入适量鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁，再加入2%尿素、0.2%硫酸镁、2%葡萄糖既得到混合培养基；（2）产氨短杆菌发酵：将产氨短杆菌按照1%-1.5%的接种量接入混合培养基中，于发酵罐内进行搅拌发酵；（3）深红酵母发酵：将发酵液内加入2%反式肉桂酸，再接入深红酵母进行发酵；（4）苯丙氨酸放罐提纯：将发酵罐内温度升至121℃，杀菌20分钟后自然冷却，放罐后离心去除菌体，通过阳离子交换树脂洗脱收集后，再进行喷雾干燥得到纯度为97%以上的苯丙氨酸。进一步地，所述步骤（2）中发酵温度为28℃，发酵时间为12到14小时。进一步地，所述步骤（3）中当检测到发酵液中pH达到8.5到9时添加反式肉桂酸，且按照1.5%-3%的接种量接入深红酵母，25℃条件下进行发酵。进一步地，所述步骤（3）中深红酵母发酵时间为48小时，通过高效液相色谱法检测，发酵液中苯丙氨酸浓度不再增加即停止发酵。进一步地，所述高效液相色谱法检测条件为，色谱柱：AlltechC18柱；流动相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱温：25℃；流速：0.65mL/min;进样量：10µL；检测器：SHIMADZU公司的LC-10ATHPLC系统，UV210nm。进一步地，所述产氨短杆菌和深红酵母均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC20101、CICC32621。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：通过产氨短杆菌和深红酵母菌的联合发酵，产氨短杆菌发酵尿素产生氨，再外加反式肉桂酸，采用深红酵母进一步发酵，产生苯丙氨酸，达到了不外加氨水的目的，且使用的都是天然工业化生产菌种，不存在转基因风险。整个发酵过程条件温和可控，工艺流程简单，也未使用强酸和强碱，在保证了生产条件温和的同时，增加了酶活，延长了酶的使用时间，并且增加了苯丙氨酸的产率。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行进一步的说明。实施例1：将大麦芽100KG除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，加入纯水400KG，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀。使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入1KG鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁410KG，再加入8.2KG尿素、0.82KG硫酸镁、8.2KG葡萄糖既得到混合培养基；将产氨短杆菌4.3KG接入混合培养基中，于发酵罐内28℃进行搅拌发酵12小时；检测发酵液pH达到8.5后，将发酵液内加入8.6KG反式肉桂酸，再接入深红酵母8.8KG于25℃下进行发酵，并通过高效液相色谱法，检测条件为：色谱柱：AlltechC18柱；流动相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱温：25℃；流速：0.65mL/min;进样量：10µL；检测器：SHIMADZU公司的LC-10ATHPLC系统，UV210nm；检测发酵液中苯丙氨酸的产量，当浓度不再增加时共发酵48小时，停止发酵；将发酵罐内温度升至121℃，杀菌20分钟后自然冷却，放罐后离心去除菌体，通过阳离子交换树脂洗脱收集后，再进行喷雾干燥得到纯度为97%以上的苯丙氨酸4.5KG。实施例2：将大麦芽200KG除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，加入纯水780KG，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀。使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入3KG鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁800KG，再加入16KG尿素、1.6KG硫酸镁、16KG葡萄糖既得到混合培养基；将产氨短杆菌12.45KG接入混合培养基中，于发酵罐内28℃进行搅拌发酵12小时；检测发酵液pH达到9后，将发酵液内加入16.8KG反式肉桂酸，再接入深红酵母25.5KG于25℃下进行发酵，并通过高效液相色谱法，检测条件为：色谱柱：AlltechC18柱；流动相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱温：25℃；流速：0.65mL/min;进样量：10µL；检测器：SHIMADZU公司的LC-10ATHPLC系统，UV210nm；检测发酵液中苯丙氨酸的产量，当浓度不再增加时共发酵48小时，停止发酵；将发酵罐内温度升至121℃，杀菌20分钟后自然冷却，放罐后离心去除菌体，通过阳离子交换树脂洗脱收集后，再进行喷雾干燥得到纯度为97%以上的苯丙氨酸10.3KG。本文档来自技高网...
【技术保护点】
多菌种联合发酵生产苯丙氨酸，其特征在于，包含有如下步骤：（1）混合培养基的制备：将大麦芽除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，以质量体积比为1:4（KG/L）的比例加入纯水，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀；使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入适量鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁，再加入2%尿素、0.2%硫酸镁、2%葡萄糖既得到混合培养基；（2）产氨短杆菌发酵：将产氨短杆菌按照1%‑1.5%的接种量接入混合培养基中，于发酵罐内进行搅拌发酵；（3）深红酵母发酵：将发酵液内加入2%反式肉桂酸，再接入深红酵母进行发酵；（4）苯丙氨酸放罐提纯：将发酵罐内温度升至121℃，杀菌20分钟后自然冷却，放罐后离心去除菌体，通过阳离子交换树脂洗脱收集后，再进行喷雾干燥得到纯度为97%以上的苯丙氨酸。
【技术特征摘要】
1.多菌种联合发酵生产苯丙氨酸，其特征在于，包含有如下步骤：（1）混合培养基的制备：将大麦芽除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，以质量体积比为1:4（KG/L）的比例加入纯水，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀；使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入适量鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁，再加入2%尿素、0.2%硫酸镁、2%葡萄糖既得到混合培养基；（2）产氨短杆菌发酵：将产氨短杆菌按照1%-1.5%的接种量接入混合培养基中，于发酵罐内进行搅拌发酵；（3）深红酵母发酵：将发酵液内加入2%反式肉桂酸，再接入深红酵母进行发酵；（4）苯丙氨酸放罐提纯：将发酵罐内温度升至121℃，杀菌20分钟后自然冷却，放罐后离心去除菌体，通过阳离子交换树脂洗脱收集后，再进行喷雾干燥得到纯度为97%以上的苯丙氨酸。2.根据权利要求1所述的多菌种联合发酵生产苯丙氨酸，其特征在于，所述步骤（2）中发酵温度为28℃，发酵...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊廷珍，
申请(专利权)人：熊廷珍，
类型：发明
国别省市：山东;37
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