丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒，属于临床体外诊断试剂技术领域。本发明专利技术的目的是能够提供有效消除内源性α‑酮戊二酸干扰且稳定性良好的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，使测定丙氨酸氨基转移酶的结果更加准确可靠。本发明专利技术的试剂盒包括试剂1和试剂2：其中试剂1的组分包括：Tris‑HCl缓冲液、L‑丙氨酸、还原型辅酶(NADH)、乳酸脱氢酶(LDH)、酶保护剂、稳定剂、防腐剂；试剂2的组分包括：Tris‑HCl缓冲液、α‑酮戊二酸、稳定剂、防腐剂。本发明专利技术所提供的ALT检测试剂盒加入酶保护剂、稳定剂，提高了丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒的稳定性，适用于各类全自动生化分析仪，操作简单、安全，便于临床应用推广。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于临床体外诊断试剂
，涉及丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒。
技术介绍
：丙氨酸氨基转移酶(ALT)是能够催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移酶，是一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶，起着加快人体内蛋白质在体内转化的作用，该酶广泛存在于人体各种组织、器官、肌肉、骨骼中，以肝脏细胞的细胞浆中最多。一旦有肝细胞遭到损害、肝功能下降、肝细胞坏死，细胞内的ALT即可释放到细胞外，从而导致血清中ALT含量升高。ALT活性升高表示有肝细胞损伤，也可见于心肌及骨骼肌损伤。血清ALT活性是肝细胞损伤的敏感指标，尤其是病毒性肝炎的重要标志，目前ALT临床上主要用来检测肝功能。体外检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)的方法主要有赖氏比色法、丙酮酸氧化酶法及连续监测法(速率法)。赖氏比色法的缺点是易受反应产物丙酮酸的反馈抑制影响，导致测定结果的准确度和精密度不高；丙酮酸氧化酶法虽然测定结果较好，但所用的4-氨基安替比林有毒、有致畸性，不满足绿色原则；连续监测法的优点是可以确定线性期并计算每分钟吸光度的变化(ΔA/min)，根据此值再准确地计算酶活性，可以利用全自动生化分析仪进行检测；酶和底物反应的特异性好，检测结果准确度高。以上三种方法相比较，采用连续监测法较佳。本专利技术的试剂盒主要采用连续监测法进行检测，其检测原理为：ALT催化L-丙氨酸的氨基转移至α-酮戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸。乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸还原的同时将还原型辅酶(NADH)氧化成氧化型辅酶(NAD+)，由于NADH在340nm处有特征吸收，所以NADH的下降速率和ALT的活力成正比。反应式如下：目前ALT检测试剂盒多采用丙酮酸氧化酶法，如CN103320497B(2015.09.09)、CN100595282C(2010.03.24)、CN1086205C(2002.06.12)均采用此法；CN104195220A(2014.12.10)主要讲到缓冲液对ALT试剂的影响；CN104404127A(2015.03.11)所述ALT试剂盒采用单一试剂，无法消除内源性干扰。本专利技术涉及的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒采用液体双试剂，可以有效消除内源性干扰，无需样本前处理，可直接利用全自动生化分析仪进行大批量样本检测，操作简单、准确度高、稳定性好，适合临床应用推广。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒供临床应用，主要解决现有ALT检测领域存在的准确度低、操作繁琐、污染环境、试剂不稳定等问题。为了解决本专利技术内源性α-酮戊二酸对丙氨酸(ALT)测定的干扰，采用如下技术方案：采用两步法检测，血清与(缺少α-酮戊二酸)的底物溶液混合，37℃保温5min，使样品中所含内源性α-酮戊二酸引起的副反应进行完毕。然后加入α-酮戊二酸启动ALT的催化反应，在主波长340nm处连续监测吸光度下降速率，根据线性反应期吸光度下降速率(-ΔA/min)，计算出ALT活力。本专利技术提供的试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中试剂1的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸650mmol/L-850mmol/L还原型辅酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L乳酸脱氢酶(LDH)2000U/L-3000U/L酶保护剂稳定剂防腐剂试剂2的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸35mmol/L-55mmol/L稳定剂防腐剂所述酶保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)或甘油与糖类中的一种或多种组合物，其用量为BSA0.1％-2％，甘油5％-20％，优选为BSA0.5％-1.5％，甘油10％-15％。以上所述糖类可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖中的一种或多种，其用量为1g/L-15g/L，优选为5g/L-10g/L。所述试剂1和试剂2的稳定剂均选自KCl及表面活性剂组合物，其用量为KCl1g/L-15g/L，优选为5g/L-10g/L。以上所述表面活性剂可选自吐温-20(Tween-20)、吐温-80(Tween-80)、曲拉通X-100(TritonX-100)、聚乙二醇6000(PEG6000)及聚乙二醇8000(PEG8000)中的一种或多种，其用量为0.1％-2％，优选为0.5％-1.5％。所述试剂1和试剂2的防腐剂均可选自NaN3或Proclin-300，其用量为NaN30.1g/L-2g/L，Proclin-3000.1％-2％，优选为NaN30.6g/L-1g/L，Proclin-3000.5％-1％。本专利技术丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒适用于各类全自动生化分析仪，现于全自动生化分析仪BS-420上的应用，其具体使用方法如下：表1样本检测操作程序计算方法：样品中的ALT含量(U/L)＝ΔAT/min×FΔAT/min：测定管平均每分钟相对空白管吸光度变化注：TV：试剂样品总体积，SV为样品体积；6.22：NADH在340nm处的毫摩尔分子吸光系数；1.0：比色皿光径(cm)；1000：U/mL到U/L的转换系数。本专利技术所使用的质控品为罗氏高、低值质控品；所测样品为不溶血血清。有益效果：本专利技术丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒为液体双试剂，采用两步法，有效消除内源性α-酮戊二酸干扰，提高了ALT测定的准确度；本专利技术试剂盒中加入酶保护剂和稳定剂，提高了ALT试剂盒的稳定性，于37℃水浴可稳定至少一周，说明2-8℃保存可以至少稳定一年。以下结合具体实施例进一步说明本专利技术，应理解，具体实施方式仅用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。附图说明：图1是本专利技术实施例1-3及对比实施例2-8℃保存一周的空白吸光度变化对比试验结果图；图2是本专利技术实施例1-3及对比实施例37℃水浴一周的空白吸光度变化对比试验结果图。具体实施方式实施例1丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：试剂1的组成：Tris-HCl缓冲液120mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸650mmol/LNADH0.2mmol/LLDH2000U/LKCl5g/L曲拉通X-1001％甘油15％蔗糖5g/LNaN31g/L试剂2的组成：Tris-HCl缓冲液100mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸35mmol/LKCl6g/LPEG80001.5％NaN30.6g/L实施例2丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：试剂1的组成：Tris-HCl缓冲液150mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸750mmol/LNADH0.3mmol/LLDH2500U/LKCl8g/L吐温-201％BSA1.5％麦芽糖10g/LProclin-3000.8％试剂2的组成：Tris-HCl缓冲液80mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸45mmol/LKCl8g/LPEG60001％Proclin-3000.5％实施例3丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：试剂1的组成：Tris-HCl缓冲液180mmol/L，P本文档来自技高网...

【技术保护点】
丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，其特征在于，试剂1的组成和成份如下：Tris‑HCl缓冲液120mmol/L‑180mmol/L，PH＝8.4L‑丙氨酸650mmol/L‑850mmol/L还原型辅酶(NADH)0.2mmol/L‑0.4mmol/L乳酸脱氢酶(LDH)2000U/L‑3000U/L酶保护剂稳定剂防腐剂试剂2的组成和成份如下：Tris‑HCl缓冲液60mmol/L‑100mmol/L，PH＝7.2α‑酮戊二酸35mmol/L‑55mmol/L稳定剂防腐剂。

【技术特征摘要】
1.丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，其特征在于，试剂1的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸650mmol/L-850mmol/L还原型辅酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L乳酸脱氢酶(LDH)2000U/L-3000U/L酶保护剂稳定剂防腐剂试剂2的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸35mmol/L-55mmol/L稳定剂防腐剂。2.如权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，其特征在于，所述酶保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)或甘油与糖类中的一种或多种组合物，其用量为BSA0.5％-1.5％，甘油10％-15％。3.如权利要求2所述的糖类，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贤俊，张敏，
申请(专利权)人：王贤俊，
类型：发明
国别省市：浙江;33