本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法。该制备方法以富马酸为原料，将分别含有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶的菌体细胞或该三种酶的粗酶液与一定浓度的富马酸铵水溶液混合，在25℃～55℃，pH 6～8进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的DL-丙氨酸。该方法采用多酶偶联生物转化技术高效制备DL-丙氨酸，具有原料来源广、生产工艺操作简便、酶促转化时间短和生产成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】一、
本专利技术属于生物
，具体涉及一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法。二、
技术介绍
DL-丙氨酸是人体的非必需氨基酸之一，可用于医药、食品、化妆品和饲料添加剂等领域，具有非常广泛的应用。目前根据文献报道DL-丙氨酸的制备方法主要有化学合成法、直接发酵法和生物酶法。1、化学合成法化学合成法有Strecker法、Buchere法、α -齒代羧酸氨化法、相转移催化合成法和L-丙氨酸化学消旋法。其中Strecker和Buchere法原料价格便宜，但中间产物水解后分离比较困难，特别是DL-丙氨酸与副产物分离比较复杂，氰化物的运输和管理难度大，国内外未见报道采用该工艺大规模生产DL-丙氨酸的企业。Kendall E C 等(Organic Synthesis, 1929, 9:4)以乙醛为原料，加入氰化氢得氰醇，加入氨溶液反应生成氨基腈，再加碱水解得到丙氨酸的钠盐，经离子交换树脂处理得到DL-丙氨酸。贾京潭(CN 1887857A)以L-丙氨酸为原料，以冰醋酸为溶剂加热至80?110°C溶解，维持温度95?100°C得DL-丙氨酸的粗品液，经分离制得DL-丙氨酸。2、直接发酵法直接发酵法生产DL-丙氨酸所用原材料为葡萄糖，根据目前已报道的发酵水平来看，糖酸转化效率较低，发酵液组成复杂提取成本高。该法的生产成本远高于化学合成法，目前国内未见有发酵法大规模工业生产DL-丙氨酸的报道。张克旭(化学工业出版社，1992,723-725)利用胶状棒杆菌N0.7183在含有葡萄糖、酵母膏、玉米浆、尿素、磷酸二氢钾和硫酸镁成分的培养基中发酵生产DL-丙氨酸，DL-丙氨酸发酵产酸率40g/L。李良铸(化学工业出版社，2006, 116-118)利用嗜氨小杆菌的精氨酸氧肟酸抗性菌株，在含有硫酸锌的葡萄糖培养基中发酵生产DL-丙氨酸，DL-丙氨酸发酵产酸率60g/L。3、生物酶法生物酶法生产工艺是以L-丙氨酸为原料、丙氨酸消旋酶为催化剂的一步生化反应，其设备简单、反应条件温和、酶活力高、反应速度快、具有专一性强的特点。酶法生产DL-丙氨酸已成为近年来人们关注和研宄的方向。黄建坡(CN 101575624A)以微生物湿菌体或粗酶液为酶源，以L-丙氨酸为底物，于20?40°C酶促转化，转化至旋光为零后0.5?2h停止反应，得到含DL-丙氨酸的反应液，经分离提取制得DL-丙氨酸，收率75%。张晓斌(CN 101580858A)以诱变的大肠杆菌湿菌体或粗酶液为酶源，以L-丙氨酸为底物，于37?40°C酶促转化，转化时间12h左右，得到含DL-丙氨酸的反应液，经分离提取制得DL-丙氨酸，其中L-丙氨酸转化率96%以上。Junlin Liu 等(World J Microb1l B1technol 2012, 28:267 - 274)以 L-丙氨酸为底物，以丙氨酸消旋酶基因工程菌(pET-32a-Alr/BL21)酶法合成了 DL-丙氨酸。三、
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是提供一种高效、低成本的以富马酸为原料直接制备DL-丙氨酸的方法。本专利技术以富马酸为原料，以天冬氨酸酶、天冬氨酸脱羧酶和丙氨酸消旋酶复合酶为生物催化剂多酶偶联制备DL-丙氨酸。本专利技术可以通过以下技术方案来达到:一种以富马酸为原料多酶偶联转化制备DL-丙氨酸的方法，其步骤为:(I)将分别具有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶；(2)将分别具有天冬氨酸酶、天冬氨酸脱羧酶和丙氨酸消旋酶活性的湿菌体或粗酶液与一定浓度的富马酸铵水溶液混合，再加入适量的磷酸吡哆醛、表面活性剂，在25?55°C，pH 6?8条件下进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离制备反应生成的DL-丙氨酸。上述步骤(I)中的培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为I?30g/L ;氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为I?30g/L ;天冬氨酸酶来源于大肠杆菌Escherichia coli，天冬氨酸-β -脱羧酶来源于徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae，丙氨酸消旋酶来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ;大肠杆菌Escherichia coli和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae购买于上海工微所科技有限公司。上述步骤(2)中富马酸铵水溶液的质量浓度为50?300g/L，加入的磷酸吡哆醛(PLP)质量浓度为0.01?1.0g/L，加入的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或 TritonX 100，其质量浓度为 0.01 ?1.0g/L。目前，我国DL-丙氨酸主要生产技术是采用具有丙氨酸消旋酶活性的微生物为催化剂，以L-丙氨酸为原料酶法消旋制备DL-丙氨酸，该法生产工艺简单、技术成熟，但是其生产成本远高于直接利用富马酸为原料的新工艺。本专利技术以富马酸为底物，以天冬氨酸酶、天冬氨酸-β -脱羧酶和丙氨酸消旋酶多酶偶联的方法制备DL-丙氨酸，省去了中间产物L-天冬氨酸和L-丙氨酸的分离提取步骤，协调酶催化反应条件，使多酶催化反应同时进行，缩短了反应时间，降低了生产成本，提高了生产效率。本专利技术所述以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法，由以下步骤构成:(I)将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌Escherichia col1、具有天冬氨酸-β -脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum分别在培养基中培养，产生高活性的天冬氨酸酶、天冬氨酸-β -脱羧酶和丙氨酸消旋酶；(2)培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为I?30g/L ;氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为I?30g/L ；(3)将分别具有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β -脱羧酶和丙氨酸消旋酶活性的湿菌体或粗酶液与质量浓度为50?300g/L的富马酸铵水溶液混合，再加入质量浓度为0.01?1.0g/L的磷酸吡哆醛、质量浓度为0.01?1.0g/L的吐温或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX 100，在25?55°C，pH 6?8条件下进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离制备反应生成的DL-丙氨酸。本专利技术与现有技术相比具有如下优点:(I)本专利技术采用的大肠杆菌Escherichia col1、徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonasdacunhae和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum,在优选的培养基中可以分别高效表达天冬氨酸酶、天冬氨酸-β -脱羧酶和丙氨酸消旋酶，使多酶偶联催化制备DL-丙氨酸有较高的反应速率和转化率，其中富马酸摩尔转化率达到95%以上，L-丙氨酸消旋效率达100%。(2)本专利技术利本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL‑丙氨酸的方法，其特征是由以下步骤构成：（1）将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌Escherichia coli、具有天冬氨酸‑β‑脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum分别在培养基中培养，产生高活性的天冬氨酸酶、天冬氨酸‑β‑脱羧酶和丙氨酸消旋酶；（2）培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30 g/L；氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30 g/L；（3）将分别具有天冬氨酸酶、天冬氨酸‑β‑脱羧酶和丙氨酸消旋酶活性的湿菌体或粗酶液与质量浓度为50～300 g/L的富马酸铵水溶液混合，再加入质量浓度为0.01～1.0 g/L的磷酸吡哆醛、质量浓度为0.01～1.0 g/L的吐温或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX 100，在25～55℃，pH 6～8条件下进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离制备反应生成的DL‑丙氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦庆才，刘均忠，吴四平，陆阳，高亮，刘茜，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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