本发明专利技术公开了一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术是以枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis?168）作为表达宿主，通过过量表达来源于酿酒酵母（Saccharomyces?cerevisiaeS288C）的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNA1），加强氨糖合成途径，得到了积累乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌基因工程菌，产量达到115mgL，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。
技术介绍
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe” (GRAS)安全级别。 因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径调控严密，并不会形成氨糖的积累。如何改造枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径是一个值得深入探讨的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为将外源葡萄糖乙酰化酶编码基因，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)克隆到表达载体pP43NMK (核苷酸序列如SEQ ID NO. 1)，然后转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168),通过改造代谢途径,实现乙酰氨基葡萄糖的积累。本专利技术优选是用表达载体pP43NMK表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤I)构建重组质粒克隆酿酒酵母的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1)，连接到重组表达质粒上；2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌将上述重组 表达载体转化枯草芽孢杆菌，得到产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌。所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168 ;所述重组表达载体为pP43NMK。本专利技术还提供了一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，将37° C、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5%的接种量转入发酵培养基，于 37。C、200rpm条件下发酵30h。重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵种子培养基(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCllO。发酵培养基(g/L):葡萄糖20，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaC110。培养条件将37° C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基， 于37。C、200rpm条件下培养30h。乙酰氨基葡萄糖的测定方法高效液相色谱(HPLC)检测法Agilent1200, RID 检测器，NH2 柱(250X4. 6mm,5μ m),流动相:70%乙腈,流速O. 75mL/min,柱温30。C,进样体积为10 μ L。本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度可达到115mgL，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。具体实施方式实施例1重组质粒的构建根据NCBI上公布的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C,购自美国典型微生物保藏中心，编号ATCC 204508)中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNAl)核苷酸序列如 SEQ IDN0.1，设计引物GNA1-F5，-GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCTTACCCG ATGGATTTTATA-3’，GNAl-R :5’ -CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’。使用上述引物从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)基因组中扩增氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNAl)。扩增片段经KpnI和HIndI 11双酶切后连接至pP43NMK表达载体(美国弗吉尼亚理工大学，张晓舟博士惠赠)。酶切验证并测序，确认重组质粒PP43-GNA1构建成功。实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建将构建好的表达载体PP43-GNA1转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心)。采用GNAl-F及GNAl-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现480bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖将37° C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于37° C、 200rpm条件下培养30h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到115mgL。过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。对照实施例1整合表达GNAl积累乙酰氨基葡萄糖根据NCBI 上公`布 pP43NMK 质粒序列(GenBank accessionno. DQ264732)及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1),设计引物 GNA1-2-F :5，-GGGGTACCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTG-3，，GNA1-2-R :5，-CGGGATCCCTA TTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’。使用上述引物从pP43_GNAl扩增GNAl表达盒，扩增片段经 KpnI和BamHI双酶切后连接至pM7Z6M整合载体(南京农业大学，闻新博士惠赠)。pM7Z6M P43-GNA1经线性化后，转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisl68)，将GNAl整合至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisl68)基因组。菌落PCR验证GNAl基因整合成功。将37° C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于37° C、200rpm条件下培养30h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到25mgL。 对照实施例2诱导表达GNAl 根据NCBI上公布的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1)，设计引物 GNA1-3-F :5’ -GGACTAGTATGAGCTTACCCGATGGATTTTAT A-3，，GNA1-3-R :5’ -CGGGATCCCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3，。使用上述弓 I物从酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiaeS288C)基因组中扩增氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1)。 扩增片段经SpeI和BamHIII双酶切后连接至pST0P1622表达载体(Technische Universital Braunschweig, Dr. Dieter Jahn惠赠)。将构建好的表达载体pSTOP-GNAl转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌，其特征是含有外源的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1。
【技术特征摘要】
1.一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌，其特征是含有外源的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNAl。2.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征是乙酰化酶编码基因为酿酒酵母来源，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因克隆于重组表达载体上。4.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤O构建重组质粒克隆酿酒酵母的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNAl，连接到重组表达质粒上；2)构建产乙酰...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，刘龙，李江华，刘延峰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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