表达高致病性禽流感H5N1血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术涉及表达高致病性禽流感(AIV)HSN1血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌(B.S.‑HA)，属于生物技术基因工程领域。本发明专利技术成功构建了高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43，并成功电击转化入枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.)。经Western‑blot验证高致病性禽流感血凝素HA蛋白在重组枯草芽孢杆菌内可以被成功表达。口服免疫可以刺激10日龄雏鸡机体产生有效的AIV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌(B.S.‑HA)有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。具体包括：高致病性禽流感的血凝素HA蛋白表达性质粒pHT43的构建，高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的表达与鉴定以及重组枯草芽孢杆菌可以促进10日龄雏鸡机体黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平。二、
技术介绍
1.高致病性禽流感(HPAIV)保护性抗原-血凝素(HA)血凝素(HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一。HA在病毒吸附及病毒穿膜过程中起关键作用，可刺激机体产生中和抗体。HA在感染过程中能否被水解为HA1和HA2两条肽链是病毒感染细胞的先决条件。近年的研究证明：HA参与病毒宿主谱的识别，在决定病毒宿主范围方面起重要作用；也是禽流感病毒抗原变异和病毒致病力的主要决定因素。HA由4个片段编码，是典型的I型糖蛋白。它含有4个结构区域：信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。用免疫学和生物学方法研究证明，HA在细胞内质网合成，合成后由内质网运送到高尔基体，最后到达细胞膜，嵌入胞膜的脂质双层，在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。HA在运送过程中经过不断的修饰，如将N-葡萄糖昔寡糖加到天门冬酞胺残基上。有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。这样形成的单体HA分布在内质网上，在向高尔基体运送过程中，由二硫键连接并折叠形成一定的形伏，随后形成三聚体，由高尔基体运送到细胞膜。HA产生后到其发挥作用时，还经过几个切割加工过程，包括N端信号肤的切除及HA1的产生。N端的信号肽大约有16个氨基酸残基组成，其作用是识别内质网，HA合成后信号肽酶将这一短肽切除，因此成熟的HA不含信号肽。另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链，产生HA1和HA2。切割时去掉一个或多个氨基酸残基，这与宿主细胞及毒株的毒力有关。HA1和HA2的分子量分别为39KD和27KD，两条肽链被一个二硫键连在一起，再加上分子内的一些二硫键及其他非共价键的相互作用，使HA形成一定的立体结构。HA是位于病毒囊膜表面的一种糖蛋自，可诱导机体产生中和抗体，为HPAIV中最为重要的保护性抗原。它不仅可诱导特异性抗体的产生，而且还可刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染，因而它一向成为禽流感疫苗研究工作中的热点，并且在评价疫苗免疫效力时往往也是将HA抗体水平作为一项重要的参考指标。目前HA基因已成功地研制出多种类型的基因工程疫苗，并且它们在抵抗同一HA亚型的病毒攻击方面显示了良好的保护力。2.枯草芽孢杆菌对黏膜免疫的影响目前对黏膜抗原的细菌递送载体，尤其是能够入侵或者定植在黏膜上皮细胞的细菌，已有广泛研究。活细菌载体的种类很多，应用比较广泛的包括两类：一类为弱毒病原体能够诱导强而持久的免疫应答，如沙门氏菌和李斯特菌，但这些减毒细菌做为载体传递疫苗存在潜在的危险性，甚至是致病性。另一类是目前较为关注的安全无致病性的共生物种，如乳球菌、乳杆菌和枯草芽孢杆菌等益生菌。枯草芽孢杆菌作为一种安全的无致病性活细菌载体，是广泛存在于土壤和植物中的优势生物种群，隶属于芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，其细胞呈直杆状，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，无荚膜，能运动。枯草杆菌作为抗原的载体具有很多优点：①是人类和动物安全纪录的益生菌和食品添加剂，②成本低廉、耐热、抗干燥、便于运输和使用，③其遗传性状和细菌学水平都很容易操纵。因此，枯草芽孢杆菌非常适宜作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原递送载体。同时枯草芽孢杆菌作为抗原递送载体可以诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答，这引起了研究者们极大的兴趣。这对于开发新型口服疫苗，提供了广阔的空间。3.口服黏膜免疫研究进展口服黏膜免疫方法简便、安全，不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答，还可引起全身性体液免疫应答，多年来受到国内外免疫学家的密切关注。目前儿童广泛口服的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰质炎口服疫苗的应用，使全球小儿麻痹发病得到有效控制，为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用。但是在实践中，口服疫苗经过消化道时常受到消化液的降解，疫苗很容易被破坏，影响免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制。近年来疫苗递送系统成为研究传染病防御领域新技术的热点之一。尤其是细菌活载体疫苗因具有培养方便，外源基因容量大，刺激细胞免疫力强等优点具有巨大的应用潜力。细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向，所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者共生菌中，让其表达所编码的抗原，以期达到预防一种或多种疾病的目的。通过活菌载体递送疫苗抗原不仅可刺激肠道局部免疫应答，又可针对特异性抗原产生特异性免疫应答，使机体可以获得全面的保护力。以前的研究表明一些减毒细菌可作为疫苗抗原的载体，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等。国外学者以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功表达了lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、HIV-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等。沙门氏菌为载体传递DNA疫苗还能存在潜在危险性。首先，减毒细菌可能存在毒力返强的危险；其次，质粒DNA可能会整合到宿主细胞基因组，从而引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。此外，减毒细菌对一些老弱病残个体可能有潜在致病性。因此，选择理想的疫苗抗原载体是建立生物学新技术的关键。理想的输送抗原的载体应该是能够在体内较长时间存在，本身对机体既安全又能产生持续免疫力的一些微生物。随着以益生菌为活载体传递抗原，刺激肠道黏膜免疫这一技术路线的提出，本专利技术试图在益生菌枯草芽孢杆菌中表达高致病性禽流感血凝素HA蛋白进行活菌的口服免疫。对研制高致病性禽流感口服疫苗，为预防高致病性禽流感开辟一条全新的黏膜免疫途径具有重要的意义。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术成功构建了高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组型枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43-HA，并转化进入枯草芽孢杆菌WB800N。高致病性禽流感血凝素HA蛋白在重组枯草芽孢杆菌WB800N内可以被成功表达，并通过口服免疫可以促进10日龄雏鸡机体黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。技术方案本专利技术涉及表达高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组枯草芽孢杆菌(B.S.-HA)，该重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。检测10日龄雏鸡口服免疫该重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株机体产生的黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平。1表达载体质粒构建方法：1.1高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因的克隆：参照已发表的高致病性禽流感的血凝素HA序列(GenBank登陆号：KP019932.1)，设计一对扩增HA蛋白基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入BamHI、SmaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：P1：CGGATCCACCATGGAAACAACTCGP2：GCCCGGGTTAAATGCAAATT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高致病性禽流感血凝素HA蛋白的整合表达质粒pHT43‑HA，是由以下方法构建而成：1.1高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因的克隆：参照已发表的高致病性禽流感的血凝素HA序列(GenBank登陆号：KP019932.1)，设计一对扩增HA蛋白基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入BamHI、SmaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：P1：CGGATCCACCATGGAAACAACTCGP2：GCCCGGGTTAAATGCAAATTCTGC以pMD19‑HA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增HA蛋白基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，69℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，4℃10min。将PCR产物用T4连接酶连接到pMD19‑T载体上，构建的载体分别命名为T‑HA。测序后获得具有高致病性禽流感的血凝素HA的DNA序列。1.2重组表达载体pHT43‑HA的构建将T‑HA质粒利用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI进行酶切得到高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因并用T4连接酶克隆至载体pHT43上，获得表达载体pHT43‑HA。1.3重组表达载体pHT43‑HA的验证采用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI，用双酶切验证重组表达载体pHT43‑HA。如图2可知：1为表达载体pHT43‑HA经BamHI、SmaI酶切得到1600bp高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因。...

【技术特征摘要】
1.一种高致病性禽流感血凝素HA蛋白的整合表达质粒pHT43-HA，是由以下方法构建而成：1.1高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因的克隆：参照已发表的高致病性禽流感的血凝素HA序列(GenBank登陆号：KP019932.1)，设计一对扩增HA蛋白基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入BamHI、SmaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：P1：CGGATCCACCATGGAAACAACTCGP2：GCCCGGGTTAAATGCAAATTCTGC以pMD19-HA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增HA蛋白基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，69℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，4℃10min。将PCR产物用T4连接酶连接到pMD19-T载体上，构建的载体分别命名为T-HA。测序后获得具有高致病性禽流感的血凝素HA的DNA序列。1.2重组表达载体pHT43-HA的构建将T-HA质粒利用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI进行酶切得到高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因并用T4连接酶克隆至载体pHT43上，获得表达载体pHT43-HA。1.3重组表达载体pHT43-HA的验证采用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI，用双酶切验证重组表达载体pHT43-HA。如图2可知：1为表达载体pHT43-HA经BamHI、SmaI酶切得到1600bp高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因。2.一种用权利要求1所述的表达质粒电转化获得的表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌(B.S.-HA)。该重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。是由以下方法转化而成：取60μL枯草芽孢杆菌WB800N电转化感受态细胞与1μL(50ng/μL)整合表达载体pIncotGSR质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm，25μF，200Ω，电击一次。加入1mL电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素抗性固体基础培养基LB平板，14-18h可见阳性菌落。3.一种用权利要求2所述的表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)口服10日龄雏鸡，可以促进10日龄雏鸡机体黏膜免疫以及AIV特异性免疫的生物学应用。动物试验以及免疫检测方法如下：3.1正常枯草芽孢杆菌WB800N菌株(遗传物质中未含有外源基因)(B.S.)和表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)分别口服免疫10日龄SPF雏鸡(口服剂量为1×1010cfu/kg)，并设立口服PBS组为空...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，牟春晓，朱立麒，杨晶晶，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32