一种枯草芽孢杆菌Z12及应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种可用于进行蛋白表达的枯草芽孢杆菌及应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Z12(Bacillus subtilis Z12)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为12750。本发明专利技术中的菌株为可被高效转化并且蛋白分泌量大的枯草芽孢杆菌，可以作为枯草芽孢杆菌表达系统的原始菌株。其转化效率可达1.8×10

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌Z12及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可用于进行蛋白表达的原始菌株--枯草芽孢杆菌Z12及应用。
技术介绍
蛋白表达技术是现代生物学的核心技术之一，表达蛋白不仅可用于生物学研究，也可以提供商业化的蛋白制品，如重组疫苗、重组胰岛素、细胞因子等产品。目前常用的表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，但是它们都各有明显的优缺点。大肠杆菌表达系统研究最充分，有多种选择，最常用的是Novagen的pET表达系统，其利用噬菌体的T7RNA聚合酶可专一性地转录T7启动子后的目的基因。在最佳条件下，目的蛋白可以达到大肠杆菌总蛋白的50％以上。尽管具有表达效率高，培养成本低等优点，但是缺点也非常明显：蛋白容易形成包涵体，复性难度和成本较高；大肠杆菌不能对蛋白进行糖基化修饰；细胞壁含有脂多糖(内毒素)，不易完全去除。另外一个常用的表达系统是酵母表达系统，其具有表达量高，可诱导，蛋白分泌到胞外易于纯化，并且具有一定的翻译后修饰能力等优点，但是缺点是部分表达产物易降解，表达量不可控，大于30KDa的蛋白几乎不能分泌。昆虫细胞和动物细胞表达系统的特点是具有完整的修饰系统，表达产物具有或者类似的天然活性，没有内毒素污染，但是表达量低，周期长，技术要求高，生产成本高。枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于水体、空气、土壤中的革兰氏阳性菌，其可以在环境不适宜的时候产生孢子，孢子可以抵御高温、干旱等极端环境，待环境适宜时再萌发进行营养生长。枯草芽孢杆菌的分泌能力强，在进行高密度发酵时，蛋白分泌量可以达到20—25g/L。其发酵生产的蛋白酶、淀粉酶、次黄嘌呤核苷、核糖甙等产品，早已经进入我们的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA评委GRAS类添加剂，其生产的益生菌及利用其生产的发酵产品已广泛应用于医药养殖业中。上世纪八十年代就开始利用枯草芽孢杆菌进行蛋白表达，其表达产物不仅包括细菌来源的各种酶类，如淀粉酶、蛋白酶、内葡聚糖酶、脂肪酶等，还包括hEGF、IFN-alpha2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同来源的蛋白。利用枯草芽孢杆菌的分泌途径，可将表达蛋白分泌到发酵液中，极大地降低了后期分离纯化的难度。枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，不含有脂多糖，便于生产注射用药品。枯草芽孢杆菌的营养要求简单，由于其已经实现规模工业化生产，大规模培养技术难度低，培养成本低。目前，枯草芽孢杆菌中的多个菌株及芽孢杆菌属中的多个种都已经完成了基因组测序工作，遗传背景清楚，安全性高，也便于进行基因组改造。但是枯草芽孢杆菌表达系统并不是一个广泛应用的表达系统，还有许多缺点待克服。枯草芽孢杆菌的模式菌168菌的野生型菌株已经丢失，目前可以得到的菌株都是其突变体。尽管其满足于科学研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是营养缺陷性突变体的特性，并不能满足建立商业化表达系统的要求。目前建立的表达系统都是基于模式菌株168建立的，尽管野生型来源的菌株和已经生产应用的枯草芽孢杆菌种非常多，不易转化都阻碍了对这些菌株的进一步改造。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供种枯草芽孢杆菌Z12，其具有转化效率高，蛋白分泌量大的特点。解决以上技术问题的本专利技术中的一种枯草芽孢杆菌Z12，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Z12，(拉丁文为Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.12750，保藏日期为2016年7月11日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述枯草芽孢杆菌菌落圆形，呈白色或淡黄色，不透明，表明粗糙，有褶皱，边缘不整齐。Z12生长过程需氧，生长最适pH7.0-8.5，最适温度30-45℃，革兰氏染色呈阳性。所述枯草芽孢杆菌应用在作为枯草芽孢杆菌表达系统的原始菌株。本专利技术中枯草芽孢杆菌的培育方法，包括以下步骤：(1)采集野生型菌种：采集含有枯草芽孢杆菌的土壤，按土壤与培养基的用量比例为1：100加入LB培养基，37℃，200rpm，培养24h，得到富含芽孢杆菌孢子的菌悬液，得到原始菌种。土壤可在原始林区，富含降解菌的地方进行采集。(2)菌株富集与筛选：取1ml菌液，85℃加热处理30min，杀死所有菌体；然后按103和105倍稀释涂板，LB培养基，37℃过夜培养；对获得的单菌落再次划线，进行纯度鉴定。(3)菌株转化筛选：菌株转化方法参见高渗转化法：感受态制备：取步骤(2)中得到的单菌落，接种到2-3mlGM(LB+0.5M山梨糖醇)培养基中，37℃，180rpm过夜培养。第二天早上按1:100接种到50mlGM培养基中，37℃，180rpm培养，待菌液生长到OD达到0.85-0.95之间时，将菌液放到冰上预冷10min；4℃，5000g，离心去上清，用等体积预冷的EM(0.5M山梨糖醇+0.5M甘露糖醇+10％甘油水溶液)重悬菌体，一共重复4次；加入约1/40体积的EM重悬菌体，保证菌液浓度在1-1.3×1010fu/ml之间。电转化：取60ul上述菌液，加入1ul待转化质粒(pDG148或者pBAV1K-T5-GFP)，质粒浓度大于100ng/ul，吹打混匀。然后加入预冷的1mm电击杯。电转化仪(EppendorfEporator)参数设定，2.1kV，实际电击时间在4.0-5.0ms时，才可能有转化菌落生长。电击后，立即加1mlRM(LB+0.5M山梨糖醇+0.38M甘露糖醇)，吹打混匀，转入5ml无菌离心管中，37℃，180rpm培养3h。将菌液离心，去上清后按一定比例稀释，取200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，同时涂布未经电转化的菌液做阴性对照。第二天早上观察菌落生长情况，若转化板有菌落生长，阴性对照没有，则表明该菌株可以被转化，需要对该菌株进行编号记录。若需要检测转化效率，则统计生长菌落总数，并乘以稀释倍数，通过质粒添加量，计算转化效率。本专利技术中采用高渗电转化法，转化质粒为pDG148或pBAV1K-T5-GFP，通过筛选得到的枯草芽孢杆菌Z12，可被高效转化并且蛋白分泌量大的枯草芽孢杆菌，可以作为枯草芽孢杆菌表达系统的原始菌株。其转化效率可达1.8×106cfu/ug，单次电击可得到约2×105个单菌落，转化效率高，可以满足建立筛选库的要求。本专利技术中发酵液蛋白浓度：通过筛选得到的Z12菌株，在LB培养基中培养48h，蛋白分泌量可以达到约378mg/L,而模式菌168只能达到约121mg/L，Z12的蛋白分泌能力远高于模式菌168。本专利技术中菌株特征及鉴定，通过筛选得到的枯草芽孢杆菌Z12的菌落形态为：菌落圆形，呈白色或淡黄色，不透明，表明粗糙，有褶皱，边缘不整齐。Z12生长过程需氧，生长最适pH7.0-8.5，最适温度30-45℃，革兰氏染色呈阳性。通过生理生化鉴定和分子鉴定，确认该菌为枯草芽孢杆菌。通过生化鉴定和分子鉴定确认该菌属于生物安全的枯草芽孢杆菌。并且该菌分泌能力强，是模式菌168的3倍以上。附图说明图1为本专利技术中Z12和168模式菌株发酵液的PAGE电泳对比图具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细描述，其中所用原始质粒为市本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌Z12，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Z12，拉丁文Bacillus subtilis Z12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为12750。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌Z12，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Z12，拉丁文BacillussubtilisZ12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为12750。2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：任钧，唐旭，曹镜，雷蕾，樊超，柴进凯，曹富明，孙楠，范佳，
申请(专利权)人：成都美溢德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51