本发明专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用，所述的枯草芽孢杆菌BS01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCC NO.60069。本发明专利技术所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清对采后水果病原菌，尤其是炭疽菌的离体抑菌活性可达90％以上，是优化前普通LB培养基发酵产生发酵液上清抑菌活性的3倍左右；以优化后发酵条件获得的BS01菌株发酵液上清对香蕉炭疽病、番茄炭疽病及鳄梨炭疽病等炭疽病的抑制作用都能达到65％以上的防效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物学领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)BS01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用。
技术介绍
炭疽菌(Colletotrichumspp.)是导致大多数果蔬采后病害的主要病原菌之一，其在芒果、番木瓜、鳄梨、番石榴、草霉等水果采后发生非常普遍，这些水果的采后损失大部分要归咎于包括炭疽菌在内的采后病原真菌所致的病害腐烂。目前防治采后病原真菌主要是采用针对甾醇合成的化学杀菌剂。然而，长期高频率地使用一类杀菌剂常引起病原菌的抗药性，已经导致防治效果下降，甚至失效。而且，化学杀菌剂的应用存在危害人体健康及污染环境等问题，因此有必要寻找新的安全且环境友好的生物防治制剂。枯草芽孢杆菌是目前最为有效的防控植物病害的生防制剂。国外已有多个枯草芽孢杆菌生防菌株获得商品化生产应用许可。我国利用枯草芽孢杆菌现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗(B-908)、麦丰宁(B3)、纹曲宁等，其防治效果都在50％以上，主要用于农作物种植田间病害的防治。目前，用于果实采后病原真菌病害控制方面的枯草芽孢杆菌制剂并不多见。CN1853489A公开的含有枯草芽孢杆菌(CCTCCM204085)发酵液和芽孢的防腐保鲜复配制剂在果实采后防腐保鲜方面的效果较好。CN101870959A公开的枯草芽孢杆菌菌株J18的发酵剂与氯化钙和壳聚糖混合制成干粉剂和被膜剂对多种水果的采后病害都有显著的防治效果。CN102851244A公开了一种防治香蕉冠腐病的芽孢杆菌菌株B28及其应用。CN104982516A公开的一种柑橘生物保鲜剂含有枯草芽孢杆菌R31。杨佐忠等利用枯草芽孢杆菌PRS5处理苹果和脐橙，也取得了较好的防腐保鲜效果(参见杨佐忠等，“枯草芽孢杆菌PRS5菌剂控制水果贮藏期病害的研究”，南京林业大学学报(自然科学版)，第30卷第1期，2006年1月)。因此，枯草芽孢杆菌在采后防腐保鲜方面具有很好的应用前景。目前来看，已公布的枯草芽孢杆菌多数必须将发酵液及活菌体与化学防腐保鲜剂或其他抑菌活性物质复配才能产生良好的抑菌活性，以达到控制果实采后病害的目的。枯草芽孢杆菌活菌体的使用存在储存时间长活性降低、对环境的适应性不稳定、定殖困难防效不稳定、使用有效剂量大、抗菌谱较窄等问题。由于枯草芽孢杆菌不同菌株的抑菌谱、抑菌作用效果等作用能力不同，差异也较大。因此分离获得新的高效菌株一直是枯草芽孢杆菌生防制剂开发应用中需要重点解决的问题，特别是筛选可在发酵过程中高产具有高效抑菌活性发酵液的菌株，以便将发酵液上清直接用于病害的防治，避免活菌体的使用存在的各种问题。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)BS01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用，本专利技术所提供的枯草芽孢杆菌BS01菌株发酵液上清对水果采后病原菌，尤其是炭疽菌的离体抑菌活性可达90％以上，是优化前普通LB培养基发酵产生发酵液上清抑菌活性的3倍左右；以优化后发酵条件获得的BS01菌株发酵液上清对番茄炭疽病、鳄梨炭疽病及香蕉炭疽病等炭疽病的抑制作用都能达到65％以上的防效。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)BS01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCCNO.60069。本专利技术所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)BS01，其单个细胞呈椭圆到柱状，菌落细小圆形，表面光滑粘稠，无明显凸起，污灰色。为进一步确定其分类学地位，扩增了BS01菌株的16SrDNA序列，经序列测定及同源性比对分析证明BS01为枯草芽孢杆菌，其16SrDNA序列(共1404bp)同已报导的多种枯草芽孢杆菌同源性达96.09％，BS0116SrDNA序列及其与基因库中登记的枯草菌BS501(登录号：FJ755787)、PRE23(登录号：EU880528)、DN2.6(登录号：EU382218)和CU03(登录号：EF522122)的同源性比对结果如图6-1、图6-2和图6-3所示。第二方面，本专利技术还提供了由第一方面所述的枯草芽孢杆菌BS01制备的复合微生物菌剂，具体可以是浓缩液、原液提取物、被膜剂等。其中浓缩液和原液提取物的制备方法可以是将由枯草芽孢杆菌BS01发酵得到的发酵液离心后去湿菌体得到的上清液，上清液经不同程度的蒸发、浓缩和干燥等工序得到，对于其蒸发浓缩干燥方法不作特殊限定；对于被膜剂的制备方法可以是，将由枯草芽孢杆菌BS01发酵得到的发酵液离心后去湿菌体得上清液，将上清液与果蜡、壳聚糖等成膜物质及其他果蔬保鲜功能组分复配制成的被膜剂，对于其具体的制备方法，本专利技术不作特殊限定。第三方面，本专利技术还提供了如第一方面所述的枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养方法，所述方法包括：取活菌浓度为1×107～1×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌BS01种子液1～4mL，接种于培养基中进行摇瓶发酵培养；所述培养基由如下组分组成：每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖1.0％～3.0％，细菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化钠0.5％～1.0％，pH值为7.0～8.0。其中的“％”表示质量百分含量。本专利技术中对枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养基组分及含量进行了优化，其中将培养基中的碳源、氮源和无机盐成分设置为葡萄糖1.0％～3.0％、细菌蛋白胨2.0％～3.0％和氯化钠0.5％～1.0％的组合，这三者之间具有协同增效作用，相比采用普通LB培养基(每1000mL水中含胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g)，其发酵产生的发酵液上清抑菌活性可提高3倍左右，对炭疽菌的离体抑菌活性可达到90％以上。本专利技术中，所述细菌蛋白胨是指市售的国产或进口peptone商品，国产的如环恺微生物产品，进口的如美国BDDifco品牌，法国Solabia品牌等等。根据本专利技术，所述培养基中葡萄糖的质量百分含量为1.0％～3.0％，例如1.0％、1.1％、1.3％、1.5％、1.7％、1.8％、2.0％、2.1％、2.3％、2.5％、2.8％或3.0％；所述培养基中细菌蛋白胨的质量百分含量为2.0％～3.0％，例如2.0％、2.05％、2.1％、2.15％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3.0％；所述培养基中氯化钠的质量百分含量为0.5％～1.0％，例如0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1.0％。根据本专利技术，所述培养基的pH值为7.0～8.0，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。根据本专利技术，所述培养基优选由如下组分组成：葡萄糖1.0％～3.0％，细菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化钠0.5％～1.0％和蒸馏水1000mL，pH值为7.0～8.0。根据本专利技术，所述培养基进一步优选由如下组分组成：葡萄糖2.0％，细菌蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％和蒸馏水1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)BS01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCC NO.60069。
【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)BS01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2016年8月29日，保藏编号为GDMCCNO.60069。2.由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BS01制备的复合微生物菌剂。3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BS01的发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括：取活菌浓度为1×107～1×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌BS01种子液1～4mL，接种于培养基中进行摇瓶发酵培养；所述培养基由如下组分组成：葡萄糖1.0％～3.0％，细菌蛋白胨2.0％～3.0％，氯化钠0.5％～1.0％和蒸馏水1000mL，pH值为7.0～8.0。4.如权利要求3所述的发酵培养方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥春，毕方铖，章斌，黄泽鹏，
申请(专利权)人：广东省农业科学院果树研究所，韩山师范学院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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