一种枯草芽孢杆菌T400及其菌剂制备方法技术

本发明专利技术涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌T400及其菌剂制备方法，所述枯草芽孢杆菌T400保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015755，该枯草芽孢杆菌T400可以通过自生固氮补充作物生长过程中所需要的氮素，还能够分泌生长素促进植物生长。所述枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法包括以下步骤：（1）分离、筛选；（2）纯化、保存；（3）培养基培养：利用发酵培养基发酵培养单菌落，得到微生物菌液；（4）菌体回收；（5）菌剂制备。本发明专利技术的工艺简单成熟，可规模化生产，制得的枯草芽孢杆菌T400具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，应用范围广，经济效益高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物菌剂
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌T400及其菌剂制备方法。
技术介绍
随着世界人口的不断增长，全球农业对化学氮肥的需求也在逐年增加。化学氮肥使用极大提高了农业粮食的产量，但同时也带来了严重的环境污染和土壤肥力下降等负面影响。在自然界中，某些原核微生物在常温常压下通过固氮酶将大气中的分子氮（N2）转化为氨（NH3），这一过程称为生物固氮，这类微生物称为固氮微生物。据联合国粮农组织统计，地球上结合态氮总量有70%来源于生物固氮，每年全球微生物固定的氮素量可达2亿吨，约占全球作物需氮量的3/4，相当于工业生产氮肥的3倍多。通过生物固氮为农作物提供氮源、提高产量、降低化肥用量、减少生产成本，同时促进了农业的可持续发展，是最节能、环保、生态友好的氮素供应方式。因此，利用各种方式进行生物固氮是目前全球所关注的一个重要问题。根据固氮微生物与宿主之间的结合关系，可以将固氮作用分为自生固氮和共生固氮，前者如棕色固氮菌、克氏肺炎杆菌、巨大芽孢杆菌等，后者如根瘤菌和放线菌。其中，根瘤菌研究已经超过100年的历史，是迄今研究的最为清楚的生物固氮体系，并且在美国、巴西、阿根廷、澳大利亚等应用广泛。但是，根瘤菌具有非常苛刻的专一侵染性，仅限于豆科作物生产使用，与禾本科等作物不能实现共生固氮。因此，通过定植于根际、根表，或者进入根的皮层组织的自生固氮微生物与水稻、玉米、甘蔗等禾本科作物联合固氮具有十分重要的应用前景。自生固氮微生物是通常在自然环境或培养基中独立生活，而且可以将大气中的分子态氮固定为氨的一类微生物。自生固氮微生物不需要和其他生物联合就能固氮，有条件宽、适应广的特点而且还能分泌一些植物激素，刺激根系和植株的生长发育，自生固氮菌能够改善植物根际的微生态群落，起到促进植物生长，提高植物抗逆性的作用。但是由于国内外特别是国内对自生固氮菌的研究起步较晚，大大限制了微生物菌剂在农业上的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种枯草芽孢杆菌T400，该功能微生物菌种枯草芽孢杆菌T400可以通过自生固氮补充作物生长过程中所需要的氮素，还能够分泌生长素促进植物生长。本专利技术的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，工艺简单成熟，可规模化生产，制得的枯草芽孢杆菌T400具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，应用范围广，经济效益高。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。一种枯草芽孢杆菌T400，所述枯草芽孢杆菌分类命名：枯草芽孢杆菌T400Bacillus subtilis T400，保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Collection)，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏日期;2015年12月15日，保藏编号：CCTCC NO：M2015755。所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为600.000-800.000 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸IAA，吲哚乙酸浓度为95-103 mg/L。优选地，该枯草芽孢杆菌T400为含有芽孢的革兰氏阳性菌。具体地，该枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性测定方法如下：试验方法：采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定。将保存的各菌株用VM-Ethanol固体培养基活化，用接种环挑取1环菌体于1.5mL的无菌离心管中，用无菌水稀释，按相同接种量接入装有5 mL半固体培养基的10 mL试管中，用反口橡胶塞密封。37℃培养24 h后，注入1/10体积的10%乙炔气体，继续培养24 h，从试管中抽取0.5 mL气体注入气相色谱仪(北京天普分析仪器厂SP-2100)中，测定乙炔、乙烯的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小（北京农业大学微生物专业编，1986）：C=(hx×c×V)/(24.9×hs×t) (2.1)其中，hx为样品峰面积值；hs为标准C2H4峰面积值；c为标准C2H4浓度(nmol/mL)；V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C2H4浓度[nmol/(mL·h)]。试验结果：结果分析，如图4所示，根据公式 (2.1) 计算可得固氮酶活性为600.000-800.000 nmol/(mL·h)。由此可以说明，枯草芽孢杆菌T400在代谢过程中可以产生特定的固氮酶，可以自生固定大气中的氮气。具体地，该枯草芽孢杆菌T400的吲哚乙酸定性含量测定方法为：生长素定性含量测定（1）挑取菌株分别接种（OD600=1.0，0.5mL菌悬液）到盛有50mL King液体培养基的250mL三角瓶中，每组3个重复。（2）接种完毕后，将三角瓶置于摇床上，28℃，125rpm，培养3d，待测。（3）取上述在King液体培养基上生长3d后的菌悬液50µL置于透明离心管中，同时加50µL比色液。（4）设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入50µL浓度为10mg/L的植物生长激素（IAA），同时加50µL比色液。阴性对照中加50µLKing液体培养基，同时加50µL比色液。（5）将阳性对照液、阴形对照液和测定液置于白陶瓷板并置于室温下15min，观察其颜色变化，颜色变红者为阳性，表示能够分泌IAA，且颜色越深表示分泌IAA的能力越强；若不变色则为阴性，表示该菌株不能分泌IAA，由此作为判断依据进行判断分析。培养基为King培养基(1L)；试剂配方为蛋白胨20g，K2HPO4 1.725g，MgSO4·7H2O 1.5g，丙三醇 15mL，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL。生长素定量测定参照 Riberio 等的方法略加改动。菌株T400接种到含有1 g/L色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180 r/min，振荡培养 48 h。将培养液10000 r/min离心 5 min，取100 mL上清液加到 96孔板中，与 100mL Salkowski’s 试剂（1 mL 0.5 mol/L FeCl3和 49 mL 35%高氯酸）混匀，室温静置 30 min，在波长 530 nm下用酶标仪测定吸光度。如图5所示，用不同浓度的IAA 标准品制作标准曲线，测定结果见表1。表1 菌株T400 IAA测定结果菌株T400T665T808T188IAA浓度（mg/L）98.3690.1286.8621.57从图5和表1可以看出，枯草芽孢杆菌T400的生长素浓度为98.36 mg/L，因此，可以判断枯草芽孢杆菌T400在生长代谢过程中可以产生IAA，具有促进作物生长的功能。所述枯草芽孢杆菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有枯草芽孢杆菌T400的固氮菌菌落的土样，经分离、筛选，培养得到固氮菌菌落。（2）纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，保存该单菌落备用。图1为分离得到的枯草芽孢杆菌T400单菌落在显微镜下放大1000倍的菌落图。（3）培养基培养：利用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌T400单菌落，得到微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌T400，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T400保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015755。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌T400，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T400保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015755。2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌T400，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为600.000-800.000nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生的吲哚乙酸浓度为95-103mg/L。3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌T400，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。4.权利要求1-3任意一项所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤：分离、筛选选取含有枯草芽孢杆菌T400的固氮菌菌落的土样，经分离、筛选，培养得到固氮菌菌落；纯化、保存在培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，保存该单菌落备用；（3）培养基培养：利用培养基发酵培养枯草芽孢杆菌T400单菌落，得到微生物菌液；菌体回收将微生物菌液离心收集枯草芽孢杆菌T400菌体，快速脱去水分，制备干燥的纯菌粉，测定芽孢数为500-800亿/g；（5）菌剂制备将干燥纯菌粉与基质物料混合，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-20亿/g，即得到枯草芽孢杆菌T400菌剂。5.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，分离、筛选的具体方法为：在土样中加入无菌水，震荡，静置，取上清液离心处理，弃上清液，保留沉淀物，加入无菌水悬浮，离心，去沉淀，取上清液再离心，弃上清液，保留沉淀物，加入磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；将样品液加入磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释的菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取菌悬液涂布于无氮培养基，培养得到固氮菌菌落。6.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于28-33℃恒温培养36-48小时，分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将单菌落保存在试管中，于28-33℃恒温培养36-48小时后置于2-5℃冰箱中保存。7.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的70-75%；（...

【专利技术属性】
技术研发人员：林敏，杨国平，孙旭生，王亚君，尹坤，杨盼盼，张学贤，陈三凤，沈世华，谭志远，燕永亮，
申请(专利权)人：东莞市保得生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44