本发明专利技术的目的是提供一种枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M2013264。本发明专利技术的枯草芽孢杆菌制剂具有改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；能够增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会；激活对虾酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、热休克蛋白、脂多糖-葡聚糖结合蛋白、信号传导及转录激活因子等与抗病原感染相关分子的表达，减缓病毒在对虾体内的增值速率；提高对虾蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进对虾消化能力和饲料养分的消化，提高对虾抗应激反应能力等多种生物学功能。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术的目的是提供一种枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M2013264。本专利技术的枯草芽孢杆菌制剂具有改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；能够增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会；激活对虾酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、热休克蛋白、脂多糖-葡聚糖结合蛋白、信号传导及转录激活因子等与抗病原感染相关分子的表达，减缓病毒在对虾体内的增值速率；提高对虾蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进对虾消化能力和饲料养分的消化，提高对虾抗应激反应能力等多种生物学功能。 CCTCC NO：M 2013264 2013.06.16【专利说明】一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
本专利技术属于益生菌筛选
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)在细菌分类上隶属于厚壁菌门 (Firmicutes)(低G+C革兰氏阳性菌）、芽孢杆菌纲（Bacilli)、芽孢杆菌目（Bacillales)、 芽孢杆菌科（Bacillaceae)、芽孢杆菌属（Bacillus)。枯草芽孢杆菌普遍存在于土壤及植 物体表，也是人、动物肠道内常见的共生菌之一。枯草芽孢杆菌是1989年美国食品药物管 理局（FDA)和美国饲料公定协会（AAFCO)公布的44种"可直接饲喂且通常认为是安全的微 生物"之一，也是2008年12月我国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录》中规定的16 种可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种之一。由于枯草芽孢杆菌具有非致病性、 分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础，所以应用十分广泛。 枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，能形成芽孢。通过对菌体进行促芽孢或微胶囊 包被处理后，枯草芽孢杆菌稳定性好，耐氧化、耐挤压、耐高温、耐酸碱，作为饲料微生物可 以100%活菌状态到达肠道，因此当前以饲料添加剂在水产养殖中的应用最多。枯草芽孢杆 菌进入动物肠道后，能迅速定植，形成微生物膜，构成肠道生物屏障，阻碍病菌的人侵和定 植。枯草芽孢杆菌在动物肠道内的繁殖还可以产生大量乳酸、乙酸，降低肠内PH，维持正常 的肠蠕动并使致病菌被排出体外。枯草芽孢杆菌属于安全、有益的微生物，在水产动物养殖 生产中有很好的应用前景。 但目前对虾养殖生产中应用的枯草芽孢杆菌菌株较少，且存在着菌种生物学性状 平平，活菌数量偏低，作用效果不稳定等不足，特别是还没有抗对虾病毒病菌株的应用。病 毒性疾病是危害对虾养殖生产的主要病害，约占对虾病害总损失率的六成，特别是对虾白 斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,简称WSSV)引起的白斑病，由于宿主范围广、 感染死亡率高，是我国乃至全世界影响最大、危害最为严重的病毒性疾病。本专利技术涉及的短 小芽孢杆菌菌株，优先考虑菌株的抗病毒活性，通过反复养殖实验证实该菌株可提高对虾 蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进对虾消化能力和饲料养分的消化，提高对虾抗应激反 应能力，从而有效阻断病毒病的发生与流行。另外，目前对虾养殖生产中应用的枯草芽孢杆 菌菌株大多是来源于陆生动物的成熟菌株，更适合陆生动物的消化道环境。本专利技术涉及的 枯草芽孢杆菌分离自健康对虾的消化道，相比于外来菌株在其自身内外环境更容易形成优 势，特别是在对虾消化道具有更优越的定植能力，从而改善对虾消化道优势菌群的组成和 数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御 病毒在消化道的黏附和增殖。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种枯草芽孢杆菌及其应用，该菌株来源于对虾消化道，具 有增强对虾细胞和体液的免疫水平，特别是提高对虾抗病毒感染能力的生物学活性，从而 弥补现有技术的不足。 本专利技术的枯草芽孢杆菌LV023(Bacillus subtilis LV023)菌株于2013年6月 16日保藏在位于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO :M 2013264〇 枯草芽孢杆菌LV023菌株可用于制备发酵菌液。 枯草芽孢杆菌发酵菌液制备方法如下：从-80°C保存的菌种挑取少量划线于 2216E固体培养基，在37°C培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37°C 摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度 控制在28°C ;当发酵液0D600值达到1. 2?1. 4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中枯 草芽孢杆菌LV023活菌浓度彡109CFU/mL。 枯草芽孢杆菌LV023的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1. 0% ;酵母粉，0. 2% ; 蔗糖，1.0% ;氯化钠，3.0% ;硫酸铁，0.001 % ;硫酸镁，0.005%。 本专利技术的枯草芽孢杆菌制剂具有：①改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形 成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在 消化道的黏附和增殖；②通过提高对虾溶菌酶、过氧化氢酶、酚氧化酶、磷酸酶、超氧化物歧 化酶等相关免疫酶活性，增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会；③激活对虾酚氧 化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、热休克蛋白、脂多糖-葡聚糖结合蛋白、信号传导及转录 激活因子等与抗病原感染相关分子的表达，减缓病毒在对虾体内的增值速率；④提高对虾 蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进对虾消化能力和饲料养分的消化，提高对虾抗应激反 应能力等多种生物学功能。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术的菌株进行详细的描述。 实施例1 :枯草芽孢杆菌的筛选 本专利技术的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)LV023菌株筛选自凡纳滨对虾消化 道。将采集的健康对虾样品放在盛有海水的充气袋中运回实验室。无菌操作台上用75% 的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌操作将活虾解剖，取出对虾肠道组织。将取出的肠道 组织用无菌的PBS(pH = 7. 0)缓冲液冲洗3-4次后，用无菌研磨棒研磨均匀。之后用无菌 PBS缓冲液适当稀释，取0. Iml涂布于2216E固体培养基上，倒置于28°C恒温培养箱中培 养16h-20h。观察2216E平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条 件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216E海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化 后的单菌落接种于2216E海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28°C振荡培养箱中培养 1611-2011，取0.81111菌悬液放入保种管中，再加入0.21111的70%灭菌甘油，混匀，用封口膜封 好，放于-80°C冰箱保存。 枯草芽孢杆菌在2216E培养基上的菌落形态：菌落直径约2-3mm，菌落呈圆形，白 色、扁平、表面粗糙干燥，边缘不整齐。 碳源利用情况为L-阿拉伯糖、a -D-乳糖、α -环式糊精、D -阿糖醇、D-丙氨酸、 2' -脱氧腺苷、β -环式糊精、麦芽三糖、D-阿洛酮糖、D-苹果酸、琥珀酸单甲基酯D-甘露 糖、L-鼠李糖、5'本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的保藏编号为：CCTCC M2013264。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓玲，许华，孙艳，李玉宏，黄倢，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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