用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用技术

本发明专利技术公开了用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用，步骤包括：（1）菌种活化：所用菌株为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，名称：

【技术实现步骤摘要】
用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用
：本专利技术具体涉及包括利用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用，属于生物工程发酵

技术介绍
：豌豆是制取粉丝用淀粉的主要豆类产品之一，含有丰富的淀粉、蛋白质和膳食纤维。在我国，除少量豌豆用来直接食用外，约98%的豌豆用来加工成淀粉、蛋白和生产粉丝。无论是传统的“酸浆法”豌豆淀粉生产工艺，还是现代的豌豆蛋白、豌豆淀粉生产工艺过程中都会产生大量废水，造成严重的环境污染。目前我国豌豆粉丝生产企业中，每生产一吨豌豆粉丝会产生13-15吨废水，而“粉丝之都”招远每年产生的粉丝废水高达600万吨。这些废水中含有丰富的蛋白质，膳食纤维，低聚糖等多种营养物质，COD、BOD、SS等指标特别高，此类污水治理难度非常大，投入成本很高，同时造成了资源的严重浪费。枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料，当作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应，在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用方面广泛应用，既能够保护环境，又可以提高农作物产品品质和食品安全。目前已有的枯草芽孢杆菌液体生物肥料菌剂有固态发酵生产工艺和液体发酵生产工艺两种。固态发酵生产工艺很难做到纯种发酵，且劳动强度大、生产环境恶劣；液态发酵生产工艺生产方式先进，但生产成本高、售价高，限制了产品的推广应用。另外有的枯草芽孢杆菌没有经过专项选育，肥效不好。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用，高质化解决豌豆蛋白厂废水的综合利用问题。本专利技术的技术方案：本专利技术用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：BacillussubtilisLD-9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13465，保藏日期：2016年12月19日。用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）菌种活化：采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH7.0-7.5；在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养10-24小时，备用；（2）摇瓶种子制备：摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖10-20，蛋白胨5-15，酵母提取物3-5，KH2PO41-3，MgSO40.2-0.5，余量水，pH6.5-7.5；250ml三角瓶装液量为20-50ml，500ml三角瓶装液量为40-80ml，115℃灭菌20-30分钟；在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速200-250rpm，培养时间6-15小时；（3）发酵种子罐液体菌种制备：发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖5-25，硫酸铵5-10，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH6.5-7.5；115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量0.5%-2.0%（V/V）；培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250rpm，通气量1：0.2-0.5,培养时间6-12小时；（4）发酵培养：发酵培养基：豌豆蛋白废水，pH6.5-7.5；115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量1%-3%（V/V）；培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250rpm，通气量前10小时1：0.2-0.3,后期1：0.3-0.5,培养时间15-25小时，菌体浓度达到2.0×109CFU/mL以上。用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂在生物肥料的应用，生产的液体菌剂稀释200倍后,以灌根法施肥于西红柿、黄瓜等蔬菜作物，显示出显著的增产、抗病效果。本专利技术同已有技术相比可产生如下积极效果：本专利技术完全以豌豆蛋白废水为培养基，能够对豌豆蛋白废水进行高质化利用，操作简单，成本低廉，效果好，解决环境污染，菌体浓度高，能够产生巨大的社会和经济效益。本专利技术利用豌豆蛋白废水生产的纳豆枯草芽孢杆菌液体菌剂在农作物栽培中应用，表现出了显著的增效、抗病毒作用。具体实施方式：下面对本专利技术的具体实施方式做详细说明：本专利技术利用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：BacillussubtilisLD-9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13465，保藏日期：2016年12月19日。菌种选育、鉴定及培养条件优化：以自然菌种富集法制作纳豆，从拉丝好的纳豆制品中分离芽孢杆菌菌株。从分离纯化的685株菌中，筛选到一株聚谷氨酸产量高的菌株，首先按芽孢杆菌的要求进行了传统方法鉴定，包括形态学鉴定和生理生化鉴定，如革兰氏染色和芽孢染色，接触酶、甲基红、V-P反应、硝酸盐培养基生长、糖发酵产酸、水解淀粉、明胶液化、卵磷脂酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、形成吲哚、分解酪素等试验，表明为芽孢杆菌属。又进行了16SrDNA的PCR扩增、PCR产物纯化和测序，利用Blast软件与基因库中已登录的16SrDNA序列进行同源性比较，菌株l6SrDNA与枯草芽孢杆菌的16srDNA序列同源性达99.12%，表明该菌株确为枯草芽孢杆菌。对该菌株的产生聚谷氨酸的培养条件进行了优化。菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。实施例1：用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其包括如下步骤：（1）菌种活化：采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH7.0；在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养10小时，备用。（2）摇瓶种子制备：摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母提取物4，KH2PO42，MgSO40.3余量水，pH7；250ml三角瓶装液量为35ml，500ml三角瓶装液量为60ml，115℃灭菌25分钟；在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速220rpm，培养时间12小时。（3）发酵种子罐液体菌种制备：发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖15，硫酸铵8，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH7；115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量1.0%（V/V）；培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250rpm，通气量1：0.3,培养时间8小时。（4）发酵培养发酵培养基：豌豆蛋白废水，pH6.9；115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量2%（V/V）；培养参数：温度37±1℃，搅拌转速200rpm，通气量前10小时1：0.25,后期1：0.4,培养时间21小时，菌体浓度达到3.8×109CFU/mL。将生产的液体菌剂稀释200倍后,以灌本文档来自技高网...

【技术保护点】
用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株，其特征在于其为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus subtilis LD‑9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。

【技术特征摘要】
1.用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株，其特征在于其为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：BacillussubtilisLD-9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13465，保藏日期：2016年12月19日。2.用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：菌种活化：采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH7.0-7.5；在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养10-24小时，备用；摇瓶种子制备：摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖10-20，蛋白胨5-15，酵母提取物3-5，KH2PO41-3，MgSO40.2-0.5，余量水，pH6.5-7.5；250ml三角瓶装液量为20-50ml，500ml三角瓶装液量为40-80ml，115℃灭菌20...

【专利技术属性】
技术研发人员：程显好，贾玉萍，李帅，张志康，徐艳，刘静，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37