一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种胡萝卜软腐欧文氏菌，保藏号为：CGMCC No. 11751，其分泌的植物免疫激活蛋白HrpN

【技术实现步骤摘要】
一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用。
技术介绍
软腐欧文氏菌是一种广泛的致病菌，主要发生在大白菜、卷心菜、菜花、马铃薯等作物上，主要为害叶、茎及块茎。叶染病近地面老叶先发病，病部呈不规则暗褐色病斑，湿度大时腐烂。近些年来，由于多方面的原因，重大病害出现的频率和面积明显增加，造成的产量损失都在50-60%左右。而这些蔬菜是我国北方地区不可缺少的重要蔬菜，但每年因病害的损失估计可达数十亿元。为了对付严重的这些蔬菜软腐病害，农业生产者大量使用化学农药。化学农药的施用也确实对蔬菜病害的控制做出了巨大的贡献。但是，化学农药的大量施用也正在显示着严重的负面影响。因此，随着生物防治、绿色农业等呼声日益高涨，植物抗病免疫技术的研究成为近年兴起的重要研究领域。植物免疫抗病激活剂是一些生物和非生物因子，能够诱导植物独特的生理状态，植物能够更好或更快或者既好又快的调配防卫反应的生理状态，使植物防御病虫害的状态处在临界，达到一触即发，当病害在侵染植物时，植物会在短时间内借助于诱导因子激发植物整体的抗性水平，调动整个植物的免疫能力，激活植物自身抗病相关基因的表达，抵抗病原物的侵染，自身不对病原菌起作用，不会使病原菌产生抗药性，用量低、高效、诱导的植物抗病谱广、抗病持续时间长，这对于植物病害的可持续控制具有重要的意义。目前利用植物免疫激活剂生物防治蔬菜病害的研究相对较少，因此，迫切需要筛选出一种能够高效分泌植物蛋白激活剂的微生物菌株，从而通过植物免疫激活剂降低软腐欧文氏菌给蔬菜生产带来的危害。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前利用化学农药防治十字花科植物软腐病带来的环境危害，提供一种能够防治软腐病害，尤其是能够高效拮抗大白菜软腐病害的植物免疫蛋白激发子，并且本专利技术还提供了一种分泌上述植物免疫激活蛋白的生物菌株，并提供其能够表达该蛋白的基因序列和蛋白质序列，本专利技术还提供工程菌构建获得免疫激活蛋白。为了达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术所述的胡萝卜软腐欧文氏菌Erwiniacarotovorapv.CarotovorastrainEcc36（简称Ecc36）于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.11751。进一步的，本专利技术所述的Ecc36能够分泌植物免疫激活蛋白HrpNEccPR，该蛋白序列如SEQIDNO:1所示。进一步的，本专利技术所述的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR能引起植物对病原菌的拮抗作用。进一步的，本专利技术所述的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR表达基因hrpNecc36的序列如SEQIDNO:2所示。进一步的，本专利技术还提供所述的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR的制备方法为：将所述胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36发酵液离心收集菌体，用发酵液1/2倍质量的无菌水悬浮，将悬浮液煮沸30分钟，9000rpm离心30分钟，收集上清，冷冻干燥，获得所述植物免疫激活蛋白HrpNEccPR粗品，其中蛋白含量不低于43%。进一步的，上述制备方法的具体步骤为：将所述胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株在LB固体培养基上采用划线法，25℃培养24小时，获得单菌落，挑取单菌落于液体LB培养基中，于25℃过夜培养，获得Ecc36菌株种子，然后以10%接种于液体LB培养基中，25℃培养48小时，9000rpm离心30分钟，收集菌体，加入原培养基1/2倍的无菌水悬浮，将其悬浮液煮沸30分钟，9000rpm离心30分钟，收集上清，冷冻干燥，获得所述植物免疫激活蛋白HrpNEccPR粗品。进一步的，本专利技术还提供所述的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR在制备用于防治植物软腐病生物制剂中的应用。进一步的，所述防治植物软腐病生物制剂中植物免疫激活蛋白HrpNEccPR的含量为18-100mg/L。本专利技术的有益效果为：本专利技术的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR可以有效抑制欧文氏菌所致的十字花科植物尤其是大白菜软腐病害，具有高效的防治作用，有效率可以达到60%以上。作为生物介入手段，可以避免化学品如农药引起的残留和污染，是一种更经济、环保、绿色的植物病害防治手段。本专利技术的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR可以制成多种生物制剂，或作为有效成分添加到现有生物菌剂中，可适应多种保存环境，并具有较长的保质期，在常温常压下，可保存1-3年，利于仓储和运输。生物样品保藏信息胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36，分类命名为Erwiniacarotovorapv.Carotovora，已于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNo.11751。附图说明图1为36号菌株对烟草形成坏死斑；图2为欧文氏菌Ecc36致病性测定结果；图3为欧文氏菌Ecc36水解酶测定结果；图4为欧文氏菌Ecc36在固体LB培养基上培养48小时的菌落形态；图5为激活蛋白HrpNEccPR粗品活力检测结果；图6为目的基因（hrpNecc36）的阳性克隆结果。具体实施方式实施例1具有激活植物免疫抗病作用的菌株分离和筛选采集大白菜发病严重地块中腐烂的大白菜作为试验材料，在实验室内从该样品中进行细菌分离，在LB培养基上进行多次分离纯化，得到纯培养菌落后，进行菌株鉴定。具体步骤：上述土壤样品来自河北省、山东、山西等地的染有大白菜腐烂病的大白菜田中，将该样品经梯度稀释后涂布于LB培养基中，于28℃恒温培养箱培养。上述培养基根据“微生物培养基手册”的记载制备得到，培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水1000ml，pH7.2~7.4，121℃灭菌20min后使用。待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌落的纯培养物，纯化后的菌株保存于LB培养基斜面。将上述筛选得到的单菌落分别培养，然后分别接种于烟草叶片，以水为阴性对照，以HrpN蛋白为阳性对照，在温度为25℃、湿度为50%情况下，正常培养接菌的烟草3天，然后挑选能使接种烟草叶片形成坏死斑的菌株，由于具有激活植物免疫抗病作用的菌株能使植物叶片产生抗性而形成坏死斑，根据坏死斑的大小来筛选具有最强激活植物免疫抗病作用的菌株，发现第36号菌株具有这些特征（图1）。并对该菌株进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.11751。实施例2具有激活植物免疫抗病作用的36号菌株毒性测试将分离的36号菌株在LB液体培养基中活化，25℃培养24h，制成菌悬液。将健康的白菜叶片用酒精棉表面消毒3次后，以无菌水冲洗3次，用灭菌接种针在每个健康的白菜叶片上针刺5孔，之后在每孔中加入LB液体菌悬液2mL，每个处理设3次重复，以加入无菌的LB培养基为对照。将处理过的白菜叶放入白色培养盆中，用保鲜膜覆盖盆口保湿，置于恒温培养箱中25℃培养，24h后观察发病情况并比较是否与田间发病症状一致（图2）。将分离的36号菌株接种到含0.5%蔗糖的微盐培养基，25℃摇瓶培养至OD600=2.5，离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 36，该菌于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11751。

【技术特征摘要】
1.一种胡萝卜软腐欧文氏菌Erwiniacarotovorasubsp.CarotovorastrainEcc36，该菌于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.11751。2.权利要求1所述的胡萝卜软腐欧文氏菌分泌的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR，其特征在于：其具有SEQIDNO:1所示的蛋白序列。3.表达权利要求2所述蛋白的基因，其特征在于：其具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。4.权利要求2所述的植物免疫激活蛋白HrpNEccPR粗品的制备方法，其特征在于：将所述胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36发酵液离心收集菌体，用无菌水悬浮，将悬浮液煮沸，离心收集上清，冷冻干燥，获得所述植物免疫激活蛋白HrpNEccPR粗品。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述无菌水的用量为发酵液质量的1/2，将所述悬浮液煮沸30分钟，在9000rpm下将悬浮液离心30分...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾振华，宋水山，刘方，黄亚丽，宋聪，郝少彦，李海利，赵芊，黄媛媛，马宏，刘昆昂，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13