克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产α-酮异戊酸和异丁醇的应用。该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。利用改造的克雷伯氏肺炎杆菌在中性pH和微氧条件下发酵生产α-酮异戊酸和异丁醇。本发明专利技术提供的方法，生产菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。

【技术实现步骤摘要】
克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法。
技术介绍
α-酮异戊酸是一种α-酮酸，α-酮酸不稳定，容易脱羧，导致自然界天然存在的α-酮酸很少。在生物体内，α-酮酸一般仅以中间体的形式存在，作为生物体内多种物质的前体。α-酮异戊酸是一种重要的细胞中间代谢产物。α-酮异戊酸是L-缬氨酸，L-亮氨酸和泛酸合成的前体，现在作为慢性肾脏疾病患者服用L-缬氨酸，L-亮氨酸的替代品。利用α-酮异戊酸作为原料，利用L-缬氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化反应，可以还原氨基化合成L-缬氨酸(ApplMicrobiolBiotechnol,1990,34:236-241)。目前未见野生微生物合成α-酮异戊酸的公开报道。肉桂地链霉菌通过诱变筛选2-酮基丁酸和缬氨酸耐受突变株，或2-酮基丁酸和异亮氨酸耐受突变株。通过诱变筛选获得一株突变株，72小时可以合成2.4g/Lα-酮异戊酸。谷氨酸棒杆菌中敲除aceE基因，aceE是丙酮酸脱氢酶复合物中一个亚基的编码基因，敲除转氨酶基因ilvE，同时表达ilvBNCD基因，再敲除丙酮酸：醌氧化还原酶基因pqo构建工程菌株，该工程菌株可以21.8g/L的α-酮异戊酸(AppliedAndEnvironmentalMicrobiology,2010,8053–8061)。异丁醇是一种支链脂肪醇，用作溶剂和合成其他种化学品的原料。异丁醇具有与汽油接近的能量密度，吸水性弱，挥发性低，辛烷值高，这些特点使得异丁醇成为一种潜在的液体燃料。目前仅发现酿酒酵母等少数微生物可以合成微量的异丁醇，商品异丁醇由化学合成法生产(Nature,2008,451,86-89)。目前报道的其他生物法合成异丁醇都是在宿主细胞中构建新的代谢途径来实现。将来源于将乳脂乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因克隆到大肠杆菌，并同时表达alsS，ilvC和ilvD基因，工程菌株可以利用葡萄糖合成3g/L的异丁醇(生物技术通报，2011,8,208-212)。将宿主大肠杆菌基因组的pflB，frdAB，fnr和AdhE基因敲除后，工程菌株的异丁醇产量提高到4.2g/L(生物技术通报，2012,170-175)。利用谷氨酸棒杆菌为宿主，表达来源于枯草芽孢杆菌的alsS基因，来源于谷氨酸棒杆菌的ahdA，ilvC和ilvD基因，来源于乳脂乳球菌的kivd，工程菌株28小时可以合成2.6g/L的异丁醇(ApplMicrobiolBiotechnol,2010,87:1045–1055)。利用枯草芽孢杆菌为宿主细胞，表达枯草芽孢杆菌来源的alsS基因，酿酒酵母来源的adh2基因，来源于乳脂乳球菌的kivd基因，通过其他基因改造后获得的工程菌株可以合成2.62g/L的异丁醇(ApplMicrobiolBiotechnol,2011,91:577–589)。克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏肺炎杆菌用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产菌株，具有底物转化率高和产物终浓度高等优点。未发现关于克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其应用于生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。优选地，一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。所述乙酰乳酸脱羧酶是指催化乙酰乳酸脱羧生成乙偶姻的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQIDNO.1所示，Genebank编号为(geneID206569613)；所述乳酸脱氢酶是指催化丙酮酸还原成乳酸的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342中基因阅读框如SEQIDNO.2所示，Genebank编号为(geneID206567865)。本专利技术还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产α-酮异戊酸和异丁醇中的应用。本专利技术还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到培养基中，进行发酵培养。优选地，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L。碳源选自能代谢转化成丙酮酸的化合物，具体包括葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液、以及它们的混合物。所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间。进一步优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。优选地，所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法还包括：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶失活对克雷伯氏肺炎杆菌进行改造，改造后的克雷伯氏肺炎杆菌利用碳源进行发酵培养时，碳源转化形成α-酮异戊酸和异丁醇，并在发酵液中积累。本专利技术提供的方法，生产菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例1利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01，AC01)乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，来实现乙酰乳酸脱羧酶活性失活。为CGMCC1.6366的菌株已经在公开文献(WeiDong,WangMin,ShiJiping,HaoJian.RedrecombinaseassistedgenereplacementinKlebsiellapneumoniae.JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中也已经公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见(HaoJian,等.Isolationandcharacterizationofmicroorganismsabletoproduce1,3-propanediolunderaerobicconditions.WorldJournalofMicrobiologyBiotechnology2008,24:1731-1740)。1)利用PCR扩增CGMCC1.6366菌株乙酰乳酸脱羧酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。克雷伯氏肺炎杆菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎杆菌，其全基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。2.一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。3.一种克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇中的方法，该方为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到培养基中，培养菌体，菌体将培养基中的碳源转化成α-酮异戊酸和异丁醇；所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌，或者为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。4.如权利要求3所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇中的方法，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到培养基中，发酵温度为25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间，培养菌体。5.如权利要求3所述的一种克...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝健，顾金杰，周吉东，魏东，史吉平，姜标，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31