一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1‑0039，已于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016663。该菌株在只含有棉粕的培养基中即可实现对游离棉酚的降解，无需额外添加碳源，大大降低了棉酚降解的成本；而且，采用本发明专利技术的枯草芽孢杆菌，在2％的接种量、发酵培养48h的条件下，即可达到97.81％的棉酚降解率，实现了对游离棉酚快速、高效的降解。同时，还能利用棉粕发酵生产中性蛋白酶和酸溶蛋白，中性蛋白酶的酶活性最高可达4101U/g，酸溶蛋白的含量可达26.96％。

【技术实现步骤摘要】
一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物

技术介绍
随着我国饲料工业和养殖业的迅速发展，一些常规饲料，尤其是蛋白质饲料严重缺乏。蛋白质饲料资源紧缺已成为当今我国饲料行业的一个突出问题，并将长期成为我国畜牧业及养殖业发展的瓶颈。寻求非常规蛋白质饲料对我国畜牧业的发展起着非常重要的作用。我国是一个产棉大国，年产棉籽量达到1100万吨，年产棉粕量在600万吨以上，占蛋白粕总量的10.7％。棉籽饼粕是棉花作物的重要副产品，是棉籽经脱壳、加热、压扁成薄片用己烷浸出油后，所剩余的副产品。棉籽饼中营养丰富，内含蛋白质40％以上(与豆饼接近)，粗纤维11-15％，赖氨酸1.59％，蛋氨酸0.52％，以及较多的维生素B，硫胺素和有机磷等，是畜禽饲料中非常有价值的一种原料。然而，棉籽饼中含有棉酚、环丙稀脂肪酸、单宁等有毒物质，制约了其在畜牧业中的应用，其中最主要的是棉酚。棉酚(gossypol)俗称棉毒素，占普通棉籽的0.7％-4.8％，是锦葵科棉属植物色素腺产生的多酚二萘衍生物，存在棉花的根、茎、叶和籽实的色素腺体中，尤其是籽实棉仁的球状腺体中含量较多。最早是由英国化学家Longmore从棉籽中分离出来的，是一种黄色的色素物质。棉酚纯品是由俄国人Marehiewski于1899年最先从棉籽油的下脚料中分离出来的，棉酚纯品为黄色结晶，能溶于低沸点石油醚和水，熔点181-185℃，分子式为C30H30O8，分子量518.55。棉籽体内棉酚的存在形式有两种，即结合棉酚和游离棉酚。结合棉酚在机体消化系统中不被吸收，可很快随粪便排出体外，毒性很低。游离棉酚分子结构中的活性基团(醛基和羧基)对动物毒性很大，游离棉酚含量在0.02％时无毒，0.02％-0.05％时轻微毒性，高于0.15％时具有强毒性。棉籽饼粕在饲料中的用量只有40％左右，极大限制了棉粕在畜禽饲料中的应用。长期饲喂动物过多的棉粕饲料，尤其是未将棉粕进行脱毒处理时，棉酚含量会在动物体内蓄积，引发中毒。导致动物出现急性呼吸窘迫临床症状，厌食乏力，甚至死亡等。因此有必要寻求一种有效方式来利用棉籽粕，降低棉酚含量，这对解决我国蛋白资源严重短缺发挥巨大作用。目前，降解棉酚的方法主要有化学法、物理法和微生物发酵法等，其中微生物发酵法是对棉籽饼粕中棉酚进行降解的一种新方法，该方法不仅能降解棉籽粕中的游离棉酚，而且还可改善棉籽粕粗饲料的营养价值和饲用价值，增加适口性和采食量，提高棉粕的利用率，是目前普遍认为的成本低、效果好、较安全的脱毒方法。但不同微生物菌种对棉酚的降解能力有较大的差异，筛选优良的微生物菌种是影响棉籽饼粕脱毒效果和营养价值的首要步骤。目前报道的用于棉籽饼粕脱毒的菌株种类较少，且主要集中于酵母菌和霉菌。而对于降解棉酚的枯草芽孢杆菌，相关的研究主要有：“高效降解棉酚菌株的筛选鉴定及毒性试验”(中国农学通报，2012，28(12)：112-117)和“棉酚降解菌株的分离及对棉饼的脱毒效果”(江苏农业科学，2012，40(11)：220-224)。上述研究分别从保定某棉花田地和保定某地棉籽榨油厂内的土壤中筛选得到具有降解棉酚作用的枯草芽孢杆菌菌株M-9和菌株M-4，上述菌株M-9和菌株M-4虽然对棉酚具有较高的降解活性，但仍存在一些不足，如：在对棉籽饼粉进行发酵脱毒时，需要额外加入碳源(蔗糖等)，增加了棉酚降解的成本；而且菌种的接种量大(10％)、降解所需时间长(60h以上)。上述不足限制了其在棉酚脱毒中的应用，因此，筛选新的具有快速、高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌具有十分重要的意义。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术的第一方面，提供一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，即为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039，已于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为CCTCCNO:M2016663。该菌株是从新疆棉籽饼粕中分离得到的，将菌株BLCC1-0039的纯培养物接种于芽孢杆菌培养基平皿，37℃培养20h，形成灰白色菌落，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状。光学显微镜下观察，革兰氏阳性，杆状。本专利技术的第二方面，提供一种菌剂，其活性成分为上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039的发酵产物。本专利技术还提供上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：发酵上述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039，得到发酵产物。上述制备方法中，发酵采用的发酵培养基的组成为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、初始pH7.0，均为质量百分比。上述制备方法中，发酵的条件为：35-40℃、罐压0.05MPa、搅拌转速220-260rpm、通气量20m3/h，待芽孢率≥90％时，发酵结束。本专利技术的第三方面，提供上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039和/或菌剂在降解游离棉酚中的应用。进一步的，上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039和/或菌剂在降低棉籽粕的游离棉酚含量中的应用。本专利技术还提供上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039在发酵棉粕生产中性蛋白酶和酸溶蛋白中的应用。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术首次从新疆棉粕中筛选分离得到一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，该菌株在只含有棉粕的培养基中即可实现对游离棉酚的降解，无需额外添加碳源，大大降低了棉酚降解的成本；而且，采用本专利技术的枯草芽孢杆菌，在2％的接种量、固体发酵48h的条件下，即可达到97.81％的棉酚降解率，实现了对游离棉酚快速、高效的降解。(2)本专利技术的枯草芽孢杆菌在降解棉酚的同时，还能利用棉粕发酵生产中性蛋白酶和酸溶蛋白，中性蛋白酶的酶活性最高可达4101U/g，酸溶蛋白的含量可达26.96％。附图说明图1：BLCC1-0039的菌落培养性状；图2：BLCC1-0039的菌体形态(油镜观察)；图3：BLCC1-0039菌株固体发酵新疆棉粕产中性蛋白酶曲线。具体实施方式结合实施例对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。本专利技术实施例2和实施例5中所提及的“接种量”是指：每100g物料中接种的菌株种子液的体积，mL/100g。实施例1：菌株的筛选与鉴定1材料与方法1.1试验材料棉粕由新疆泰昆集团提供；醋酸棉酚购自陕西慈缘生物技术有限公司。1.2培养基初筛培养基：醋酸棉酚0.10％、氯化钠0.10％、硫酸铵0.50％、七水硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.10％和琼脂2.0％，吐温-800.75％；均为质量百分数。初筛斜面培养基：醋酸棉酚0.10％、氯化钠0.10％、硫酸铵0.50％、七水硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.10％和琼脂2.0％，吐温-800.75％；均为质量百分数。营养肉汤培养基：蛋白胨1.0％、牛肉膏0.3％、氯化钠0.5％，均为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1‑0039，已于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016663。

【技术特征摘要】
1.一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039，已于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为CCTCCNO:M2016663。2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039的发酵产物。3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0039，得到发酵产物。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵采用的发酵培养基的组成为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：单宝龙，陈雷，王春凤，谷巍，谢全喜，姜延龙，王红，亓秀晔，陈振，徐海燕，于佳民，张志焱，辛国芹，
申请(专利权)人：山东宝来利来生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37