一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术将枯草芽孢杆菌产生的抗菌活性肽作为生物防霉剂应用于饲料，尤其是鱼饲料的保鲜中；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BSh0851。本发明专利技术还提供了在饲料中添加该活性肽的新方法：抑菌物质覆膜工艺。该工艺利用枯草芽孢杆菌肽具有油溶的特点，结合饲料生产中最后一道喷油工艺，在成品上添加抑菌膜，可有效提高产品货架期。该工艺不需要调整饲料配方，操作便捷、可操作性强，且活性肽使用量少、节约成本。目前，常用的防霉剂使用是添加在饲料中，因此需要调整配方，且用量较大。本发明专利技术方法工艺简单、安全，防霉保鲜效果显著。

Preparation method of Bacillus subtilis metabolite and application thereof

The antibacterial peptide produced by Bacillus subtilis as biological fungicide should be used to feed, especially fish feed preservation; the Bacillus subtilis Bacillus subtilis BSh0851. The invention also provides a new method for adding the active peptide in the feed: the bacteriostatic substance and the film coating process. In the process, the Bacillus subtilis peptide has the characteristics of oil solubility and combines the last injection process in the feed production, and the antibacterial film is added on the finished product, so that the shelf life of the product can be effectively improved. The process does not need to adjust feed formula, the operation is convenient, the operation is strong, and the use of active peptides is little and the cost is saved. At present, the commonly used fungicide use is added in the feed, so need to adjust the formula, and the larger amount. The method of the invention is simple and safe, and has obvious effect of mildew prevention and preservation.

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法及其应用
本专利技术属于饲料防霉保鲜技术，具体涉及一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法及其应用。
技术介绍
饲料产业发展应朝“绿色无公害”和“新型高端”饲料发展，实现“量”与“质”同步提升，加快产业转型。饲料在存放过程中容易发生霉变，轻则影响产品外观，如表面裂纹、白斑；结块或容易解崩、产生酸败或不良气味影响诱食和捕食；严重将导致霉菌毒素的产生。防止饲料霉变通常通过控制水分和添加防霉添加剂。目前使用最广泛的添加剂是丙酸及其盐类(包括丙酸钠、丙酸钙、丙酸铵和二丙酸铵)。在实际生产中，对高档的饲料，尤其是高值水产饲料如鳗鱼、鲍鱼饲料等，控制较低的水分不利于喂养时饲料的复水，影响饲料的柔软性，从而不利于鱼类捕食。另一方面，在高水分却不改变饲料pH值，不影响饲料水质和饲料品质的前提下，丙酸及其盐类防霉剂难以在货架期内保持无霉变发生。因此需要寻找具有抗菌力、安全性、适口性、适用性和经济性兼具的防霉添加剂。生物抑菌剂以其安全性高、能耗低的优势成为开发新热点。目前常用的微生物源抑菌剂主要有乳酸菌素和纳它霉素。纳它霉素是针对真菌的防霉保鲜剂，但其不溶于水和有机溶液。本专利采用一株具有显著抑制饲料霉菌活性的枯草芽孢杆菌（保藏号：BSh0851）；并对其发酵活性代谢物质进行了结构鉴定，表明其为脂肽类表面活性物质；并经过液体发酵条件优化后，活性物质产量可达450mg/L，具有很好的发酵优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法及其在鱼饲料防霉中的应用，为饲料，特别是含水量稍高的鱼饲料防霉保鲜提供新的途径。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法，包括如下具体步骤：（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r·min-1，培养24h；种子培养基的配方为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏15g，无水葡萄糖15g，MgSO41g，蒸馏水1000mL，pH7.0；分装，装液量为三份之一体积；灭菌备用；（3）枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%vol；于37℃、转速100r·min-1条件下培养24h；（4）将步骤（3）的发酵液6000r·min-1离心10min，去除菌体后，上清液进行冷冻干燥，得到含枯草芽孢杆菌表面活性肽的冻干粉。其活性物质含量为50mg/g。其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtulis）BSh0851，保藏日期为2009年12月13日，保藏单位是中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.3502。该枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭；需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，V-P阳性。本专利技术的另一目的在于提供一种所述枯草芽孢杆菌表面活性肽冻干粉末在鱼饲料防霉中的应用，其具体步骤为：（1）将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以1g/L的添加量添加入鱼油中；（2）以每50L鱼油覆膜1吨鱼饲料产品，且饲料含水率在10%左右；（3）对所生产的饲料定期进行外观和菌落生长检测。此枯草芽孢杆菌活性肽冷冻干燥浓缩物可有效抑制饲料中的真菌生长，包括鱼饲料中常见的多种酵母菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉和白地霉。采用0.05%的冷冻干燥浓缩粉对酵母菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉和白地霉进行平板抑菌实验，结果表明，7d后，抑菌圈直径分别为无生长（完全抑制）、0.3cm、0.45cm、0.6cm、0.8cm和1.4cm。将冷冻干燥粉末以1g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油。使用本专利技术的保鲜剂对饲料进行防霉处理，正常放置6个月，肉眼未可见霉变。本专利技术的有益效果如下：首先，应用该枯草芽孢杆菌发酵生产表面活性肽其发酵产量高、提取工艺简单。其次，该枯草芽孢杆菌代谢的活性肽对多种霉菌具有生长抑制作用，对鱼饲料霉变起到很好的预防效果；该工艺不需要调整饲料配方，操作便捷、可操作性强，且活性肽使用量少、节约成本。具体实施方式：本专利技术以饲料外观为评判指标，以饲料含菌量作为辅助指标用于评判本保鲜剂对饲料防霉的效果。将刚挤压膨化制成的饲料和反接根霉和曲霉的饲料，采用不同浓度梯度的活性肽鱼油覆膜，并采用空白鱼油做1组对照。枯草芽孢杆菌代谢产物的制备，包括如下具体步骤：（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r·min-1，培养24h；种子培养基的配方为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏15g，无水葡萄糖15g，MgSO41g，蒸馏水1000mL，pH7.0；分装，装液量为三份之一体积；灭菌备用；（3）枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%vol；于37℃、转速100r·min-1条件下培养24h；（4）将步骤（3）的发酵液6000r·min-1离心10min，去除菌体后，上清液进行冷冻干燥，得到含枯草芽孢杆菌表面活性肽的冻干粉。其活性物质含量为50mg/g。实施例1：对比实施例将刚挤压膨化制成的饲料用空白鱼油喷淋，制成饲料成品，作为对照组。实施例2将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以0.5g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油喷淋。实施例3将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以1g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油喷淋。实施例4将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以2g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油。饲料评判标准为：具有光泽，饲料表面看不到菌丝生长，不见白斑或起丝（无霉变，记为“-”）；无光泽，饲料表面出现轻微斑点或菌丝，但内部没有斑点或菌丝（轻度霉变，记为“+”）；出现轻微白斑或菌丝，但内部未见菌丝（一般霉变，记为“++”）、出现明显白斑或裂纹，内部可见菌丝（完全霉变，记为“+++”）。采用马铃薯培养基（添加氯霉素抑制枯草芽孢杆菌生长）进行真菌培养，将直径0.8cm的饲料颗粒置于培养基中，28℃培养，判断饲料表面菌在培养基中的生长情况，并以菌落在饲料边缘长度（cm）作为染菌程度。实施案例外观结果见表1，菌落生长情况见表2。表1饲料外观评价表表2饲料表面霉菌生长情况表对高水分（含水量10%）饲料而言，由表1饲料外观评价可以看出，采用枯草杆菌活性肽含量为1g/L的鱼油覆膜，可在60d内保持无霉变状态，而对照组20d出现轻微霉变。表2表示饲料携带菌量的程度和被抑菌活性物质抑制生长的水平，枯草杆菌活性肽含量为1g/L的鱼油覆膜后，尽管仍在初期便携带菌，但被抑制的程度优于对照和低浓度实施案例。实施例5枯草芽孢杆菌的分离和鉴定（1）该菌株分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r·min

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r·min-1，培养24h；种子培养基的配方为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏15g，无水葡萄糖15g，MgSO41g，蒸馏水1000mL，pH7.0；分装，装液量为三份之一体积；灭菌备用；（3）枯草芽孢杆菌发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%vol；于37℃、转速100r·min-1条件下培养24h；（4）将步骤（3）的发酵液6000r·min-1离心10mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雯，张绍升，倪莉，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35