产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，涉及一种基因工程菌株及其构建方法。本发明专利技术的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAPc2融合蛋白，该融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAPc2基因。方法：一、融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的合成；二、重组表达载体构建；三、将重组表达载体转化到大肠杆菌中，提取转化菌质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，基因测序，测序结果正确的为阳性重组菌。本发明专利技术用于生产具有抗血栓和治疗高血压双重作用的融合蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种基因工程菌株及其构建方法。
技术介绍
Rosenfeld等于1983年发现降钙素基因相关肽(CGRP)是ー种生物活性肽，它与降钙素(CT)均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，但是由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因重组和分子生物技术研究发现的ー种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，是目前发现的最強的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素(NE)，比こ酰胆碱(Ach)、5-羟色胺(5-HT)等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10-100倍。犬钩虫吸血时，其头腺能分泌ー种抗凝血活性物质，被称作犬钩虫抗凝血肽(anticoagulant peptide, AcAPs)。该物质本质是ー种蛋白水解酶,具有延长血衆凝血酶原时间(Pt)、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。目前发现的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重组蛋·白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特异抑制剂，其抗血栓效果明显优于凝血酶抑制剂，AcAPc2作为Xa因子的高效特异抑制剂对血小板聚集功能影响甚小，用于抗血栓治疗时引发出血的危险性小。1998年，Donnelly等报道AcAPc2在体内还具有抗肿瘤细胞转移的作用。AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成为临床上ー种新的抗凝剂和抗血栓治疗药物。然而目前这两种蛋白単独作用，效果单一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种，该菌株可以生产CGRP-AcAPc2融合蛋白，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本专利技术产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。上述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计ー个Kpn I酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (CGRP/AcAPc2)载体；ニ、将步骤一获得的pUC (CGRP/AcAPc2)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAPc2 ；三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，随机挑取转化菌37°C过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。本专利技术的有益效果本专利技术基因工程菌株可以生产CGRP_AcAPc2融合蛋白，降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2之间作用互补且协同增效，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本专利技术基因工程菌株生产的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38. 1%。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。具体实施方式ニ具体实施方式一所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。具体实施方式三具体实施方式一所述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计ー个Kpn I酶切位点，由上海生エ公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (CGRP/AcAPc2)载体；ニ、将步骤一获得的pUC (CGRP/AcAPc2)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAPc2 ；三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，随机挑取转化菌37°C过夜培养，采用质粒提取试剂盒(购买自北京艾德莱生物科技有限公司)提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌；其中大肠杆菌BL21 (DE3)为购买得到。步骤ニ中pUC (CGRP/AcAPc2)载体用BamHI和EcoR I双酶切的体系如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/?AcAPc2基因。
【技术特征摘要】
1.产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。2.根据权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 ο3.如权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行 一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnI酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (CGRP/AcAPc2)载体； 二、将步骤一获得的pUC(CGRP/AcAPc2)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体 pGEX-CGRP/AcAPc2 ； 三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21(DE3 )中，随机挑取转化菌37 °C过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用Kpn I单酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：余琼，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：
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