一株重组大肠杆菌及用其制备磷脂酶A1的方法技术

本发明专利技术提供一株重组大肠杆菌及用其制备磷脂酶A1的方法。本发明专利技术成功构建了一株磷脂酶A1基因来源于杨氏柠檬酸杆菌CICC?No.21596的基因重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-phla?CCTCC?No:M2012424，用该菌株进行液体发酵来制备溶血性磷脂酶A1，其制备方法包括斜面培养、种子培养、液体发酵培养以及粗酶液的提取。利用本发明专利技术菌株通过液体发酵制备磷脂酶A1，具有产酶量和酶活性高、生产工艺简单、生产周期短、成本低、易于工艺放大等优点，为磷脂酶A1的规模化生产奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和微生物发酵
，具体涉及一株重组大肠杆菌及用该菌株进行液体发酵来制备磷脂酶A1的方法。
技术介绍
磷脂酶A1 (Phospholipase A1, EC 3.1.1. 32,简称 PLA1)属于水解酶,可专一水解天然磷脂Sn-1位酰基，得到Sn-2酰基溶血磷脂和游离脂肪酸。磷脂酶Al是一种优良的表面活性剂，被广泛应用于食品、医药、饲料和皮革等领域；此外，磷脂酶A1还可应用于植物油脱胶，同传统脱胶方法相比，磷脂酶A1脱胶这种新型脱胶方法具有反应条件温和、副产物少、节能环保等优点，近年来已在油脂精炼行业得到大规模推广。经证实，许多动物的细胞、组织和毒液含有少量的磷脂酶4。磷脂酶A1的传统来源为动物胰液，但该来源提取量有限且价格昂贵，已于近几年逐渐被淘汰，取而代之的是从微生物中提取，但提取自微生物的磷脂酶A1大多与细胞膜结合，难以进行规模化生产，因此，研究磷脂酶A1基因在工程菌中的克隆表达并努力提高其产量成为近年来的主要研究方向。国内外利用微生物产磷脂酶A1的起步较晚，且产量普遍较低1988年，MichaelGivskova等从液化沙雷氏菌中提取磷脂酶A1基因在大肠杆菌克隆和表达，其酶活不到IU/ml (Givskov M, Molin S.Secretion of Serratia liquefaciens phospholipase fromEseherichia. coli[J]. Mol. Microbiol,1993(8) :229-42) ；2000 年，M. Hartmann 等使用随机化学突变、单细胞融合以及基因杂交技术，筛选出4株嗜热四膜虫属突变株，其酶活最高达至丨J 35. 2 + 2. 60U/ml (Hartmann M, etal. Screening forand charaeterizationofphospholipase A1 hypersecretory mutants of Tetrahymena thermophila[J]. Appl.Microbiol. Biotechnol，2000 (54) :390-396) ；2008年，国内付建红等从新疆天山一号冰川冻土中筛选到一株产低温碱性磷脂酶A1的菌株xjFl，初步优化后，酶活力最高达17. 5U/ml (付建红，唐辉桂，姚斌，等.一株产低温碱性磷脂酶A1耐冷细菌的筛选及发酵条件的初步研究.工业微生物2008. 38 :12-16)。目前商品化的磷脂酶A1产品仅有丹麦诺维信公司的Lecitase Novo (Novozymes A/S),其是通过蛋白质修饰技术由来源于嗜热丝胞菌的脂肪酶改性而来。因此，寻找更加优良的磷脂酶A1基因并在工程菌中进行克隆表达以期提高其表达水平是亟待解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的在于提供一株重组大肠杆菌及用其制备磷脂酶A1的方法。利用该菌株通过液体发酵制备磷脂酶A1，具有产酶量和酶活性高、生产工艺简单、生产周期短、成本低、易于工艺放大等优点。本专利技术的技术方案如下一株重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET_phla，保藏编号为 CCTCCNo. M 2012424,该重组大肠杆菌包含一段来源于杨氏朽1檬酸杆菌CICCNo. 21596的phla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。其进一步的技术方案为所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-phla，CCTCC No. M 2012424由下述方法制得(I)以所述杨氏柠檬酸杆菌CICC No. 21596的基因组为模板，克隆得到所述phla基因;(2)将步骤(I)所得phla基因克隆到表达载体pET-28a ( + )上，得到重组载体pET-phla ；(3)将步骤(2)所得重组载体pET-phla转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到能表达磷脂酶A1的重组大肠杆菌。本专利技术还提供了一种用上述重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-phla, CCTCCNo. M2012424制备磷脂酶A1的方法，是以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备磷脂酶A1O其具体步骤如下(I)种子培养将经过斜面培养的所述重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-pla，CCTCCNo. M 2012424单菌落接种于种子培养基，于35 37°C振荡培养5 7h，摇床转速180 200r/min ；(2)液体发酵培养 将上述种子培养所得活化种子液按体积百分比广4%的接种量接种至发酵培养基，于35 37°C振荡培养3 5h小时，摇床转速180 200r/min ；向所述发酵培养基中添加其总重量0. 2 I %的乳糖，继续培养12 14h ;发酵完毕，得到发酵液；(3)粗酶液的提取将上述发酵液离心；收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。其进一步的技术方案为步骤(I)所述斜面培养的培养基成分以IL计为蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，氯化钠I，其余成分为水，调节pH值至7. 4 ;所述种子培养基成分以IL计为蛋白胨10g，酵母粉 5g，葡萄糖 8g，Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分为水；上述种子培养基还包括终浓度为IOOy g/ml的卡那霉素。步骤(2)所述发酵培养基成分以IL计为蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖0.5g，甘油 5g, Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM, FeCl3 50 u M, CaCl220iiM，其余成分为水； 磷脂酶A1酶活测定方法如下采用改良 NaOH 滴定法(Sheelu 等，J Am Oil Chem Soc 85 :739-748，2008)。将 4g已乳化的大豆卵磷脂溶于100ml 50mM的磷酸缓冲液(pH 7. 0)，取20ml该溶液和稀释5倍的粗酶液在转速为180r/min的恒温震荡水浴锅中于50°C预热10分钟；取200 y L已稀释的粗酶液加入上述反应体系中精确反应10分钟；立即补加15ml的95%乙醇终止反应。用已标定的30mmol/L NaOH溶液滴定上述粗酶液中磷脂酶A1所释放的游离脂肪酸，取pH8. 2为滴定终点；磷脂酶A1酶活力定义为在上述反应条件下，每分钟释放I U mol的游离脂肪酸的酶量定义为一个酶活力单位。本专利技术所提供的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/ET_phla,已于2012年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC NO M 2012424，地址中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-phla CCTCCM 2012424。本专利技术的有益技术效果如下本专利技术成功构建了一株磷脂酶A1基因来源于杨氏朽1檬酸杆菌CICCNo. 21596的基因重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-phla CCTCC M 2012424，分析结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株重组大肠杆菌（Escherichia?coli）BL21（DE3）/pET?phla，保藏编号为CCTCC?No.M?2012424，其特征在于：该重组大肠杆菌包含一段来源于杨氏柠檬酸杆菌CICC?No.21596的phla基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一株重组大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)/pET-phla,保藏编号为CCTCC No. M 2012424，其特征在于该重组大肠杆菌包含一段来源于杨氏柠檬酸杆菌CICCNo. 21596的phla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-phla，CCTCC No. M2012424，其特征在于由下述方法制得 Cl)以所述杨氏柠檬酸杆菌CICC No. 21596的基因组为模板，克隆得到所述pla基因； (2)将步骤(I)所得phla基因克隆到表达载体pET-28a( + )上，得到重组载体pET-phla ； (3)将步骤(2)所得重组载体pET-phla转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到能表达磷脂酶Al的重组大肠杆菌。3.用权利要求1 2任一项所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-phla，CCTCCNo. M2012424制备磷脂酶A1的方法，其特征在于以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备憐脂酶A1。4.根据权利要求3所述制备磷脂酶A1的方法，其特征在于具体步骤如下 (1)种子培养将经过斜面培养的所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-phla，CCTCCNo. M2012424单菌落接种于种子培养基，于35 37°C振荡...

【专利技术属性】
技术研发人员：张梁，石贵阳，延晋雷，丁重阳，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：