本发明专利技术提供一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌的基础上敲除苹果酸脱氢酶编码基因。本发明专利技术还提供了上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：构建苹果酸脱氢酶编码基因敲除框；并敲除枯草芽孢杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA，得到提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌。本发明专利技术的重组枯草芽孢杆菌与出发菌株相比，其乙酰氨基葡萄糖胞外积累量得到提高，且减少了副产物乙偶姻的产量。本发明专利技术的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及遗传工程领域，尤其涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。
技术介绍
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食添加中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。申请号为201510761678.6的中国专利申请中构建的枯草芽孢杆菌BSGNKAP仍然存在乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖转化效率低的缺点。由于BSGNKAP敲除了丙酮酸激酶编码基因pyk和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA后，枯草芽孢杆菌胞内的苹果酸回补途径会促使苹果酸转化为丙酮酸，丙酮酸作为多条代谢途径的代谢节点，因此苹果酸回补生成的丙酮酸会进一步转化为乙偶姻，进而导致副产物过多的积累，造成碳源利用效率较低。同时，由于苹果酸通过回补途径转化为丙酮酸，也会造成乙酰氨糖合成前体α-酮戊二酸供应不足。因此，如何提高葡萄糖的利用效率及乙酰氨基葡萄糖合成效率，是微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。鉴于上述原因，本专利技术人积极加以研究创新，以期创建一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，本专利技术的重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌(BSGNKAP)的基础上，敲除苹果酸脱氢酶编码基因，构建方法简单，具有良好的应用前景。在一方面，本专利技术提供了一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌通过敲除枯草芽孢杆菌的苹果酸脱氢酶编码基因得到。进一步地，苹果酸脱氢酶编码基因为ytsJ、ywkA、malS和mleA中的一种或几种。进一步地，苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA分别为NCBI上Gene ID:937378、Gene ID:937045、Gene ID:938071、Gene ID:938725所示。在一具体实施例中，敲除枯草芽孢杆菌BSGNKAP的苹果酸脱氢酶编码基因得到本专利技术的重组枯草芽孢杆菌。BSGNKAP通过以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，用启动子PxylA、P43分别控制glmS、GNA1的重组表达，并敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk得到，如申请号为201510761678.6的中国专利申请中所公开的。在又一具体实施例中，通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。在另一方面，本专利技术一种上述提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：(1)构建苹果酸脱氢酶编码基因敲除框；(2)经同源重组，用步骤(1)中的敲除框敲除枯草芽孢杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA，分别得到提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌。在一具体实施例中，用苹果酸脱氢酶基因的上下游序列和博来霉素抗性基因zeo的序列，构建苹果酸脱氢酶编码基因敲除框；在一具体实施例中，经同源重组将苹果酸脱氢酶编码基因敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌中的苹果酸脱氢酶基因，得到本专利技术的重组枯草芽孢杆菌。在一具体实施例中，在步骤(1)中，苹果酸脱氢酶基因的上下游序列来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168，该枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370。进一步地，苹果酸脱氢酶编码基因为ytsJ、ywkA、malS和mleA中的一种或几种。进一步地，苹果酸脱氢酶基因ytsJ、ywkA、malS和mleA的上下游序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。在一具体实施例中，用步骤(1)中的敲除框依次敲除枯草芽孢杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA，得到提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAPM4。进一步地，在步骤(1)中，苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA敲除框的序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示。在一具体实施例中，在步骤(2)中，枯草芽孢杆菌为BSGNKAP，其是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk得到，如申请号201510761678.6中构建的枯草芽孢杆菌。在另一方面，本专利技术还提供了一种上述重组枯草芽孢杆菌制备乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。进一步地，种子在35℃-37℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35-37℃发酵培养。进一步的，种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠；在一具体实施例中，种子培养基以其重量为基准，包括以下成分：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。进一步地，发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。在一具体实施例中，发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10ml/L微量元素溶液。进一步地，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。在一具体实施例中，微量元素溶液以其重量为基准，包括以下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。在一具体实施例中，将活化后的种子以5％-6％的接种量转入发酵培养基中进行培养。在一具体实施例中，诱导剂为木糖，每升发酵培养基的木糖用量为4.5g～5.5g。借由上述技术方案，与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌通过敲除枯草芽孢杆菌的苹果酸脱氢酶编码基因得到。
【技术特征摘要】
1.一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌通过敲除枯草芽孢杆菌的苹果酸脱氢酶编码基因得到。2.根据权利要求1所述的提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述苹果酸脱氢酶编码基因为ytsJ、ywkA、malS和mleA中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA分别如NCBI上Gene ID:937378、Gene ID:937045、Gene ID:938071、Gene ID:938725所示。4.根据权利要求1所述的提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌通过以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，用启动子PxylA、P43分别控制glmS、GNA1的重组表达，并敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk得到。5.一种如权利要求1-4中任一项所述的提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建苹果酸脱氢酶编码基因敲除框；(2)经同源重组，用步骤(1)中的敲除框敲除枯草芽孢杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶编码基因，得到所述提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌。6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，用苹果酸脱氢酶基因的上下游序列和博来霉素抗性基因zeo的序列，构建苹果酸脱氢酶编码基因敲除框。7...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，顾洋，邓洁莹，陈坚，堵国成，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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