本发明专利技术属于生物工程领域，具体公开一种优质D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达及其应用。所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的氨基酸序列如SEQNO.1所示。本发明专利技术通过酶活性测定和底物特异性的分析，所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶底物特异性专一强，所研究底物中针对性的将D-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以及β键连接的D-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)脱乙酰化生成D-氨基葡萄糖(GlcN)或者β键连接的氨基葡萄糖(GlcN)。本发明专利技术利用基因工程手段克隆表达了重组D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，实现了D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的大量表达，获得了优质的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，一种优质D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达，酶活性条件优化及其应用。
技术介绍
氨基葡萄糖(GlcN)又称葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖，在体内具有重要的生理意义：参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝、抗反应性、抗低氧的作用，刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生等；在食品，农业领域及化妆品领域中同样都有不同程度的应用。GlcN的用途如此广泛，而目前国内相关产品较少。甲壳素(chitin)又叫几丁质，壳多糖广泛分布于虾壳，蟹壳，昆虫等的甲壳中，其主要组成单位是N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，经强酸水解可得到氨基葡萄糖。因此，工业上通常采用强酸水解的方法生产氨基葡萄糖盐酸盐。但是传统的生产工艺须消耗大量的酸碱，腐蚀设备，造成环境的污染，且产率低，产物不纯，新方法条件要求高。这些在某种程度上限制了氨基葡萄糖及其衍生物的广泛应用。利用基因工程技术构建生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，然后通过发酵法产氨基葡萄糖是近期发展的另一种方法，目前，发酵法产氨基葡萄糖的研究集中在霉菌发酵与重组大肠杆菌研究上，但是该方法需要投入大量精力和资金到基因工程菌的研究上，没有形成规模化。因此，一种更加温和，环境友好，产物纯度高生产氨基多糖的方法非常迫切。据报道甲壳素酶可以把甲壳素降解为大量D-乙酰氨基葡萄糖单糖分子，研究证明甲壳素降解率高达92.6％；然后利用D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶使D-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基得到氨基葡萄糖，目前文献报道中一些脱乙酰基酶可以作用于GlcNAc，但是这些酶的主要活性不是针对D-乙酰氨基葡萄糖，或者这些酶的活性或产率不高。我们同样利用已经非常成熟的基因工程技术，通过基因搜索，克隆，重组表达和生化特性研究等获得产物单一，且转化率达到百分之百的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶。D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的反应式如下：但是从甲壳素生成D-乙酰氨基葡萄糖，再生成氨基葡萄糖的仍处于研究阶段应用，需要进一步的实际试验研究，为实现该方法的规模化生产，是我们今后要努力的方向。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种优质的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，实现D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源大量表达，相比于化学法生产氨基葡萄糖，酶法生产将具有极大的工业化潜力。本专利技术的另一目的在于提供一种D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的编码基因。本专利技术的又一目的在于提供D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的编码基因，具有下述核苷酸序列之一：(1)序列表中的SEQIDNO.2的核苷酸序列；(2)编码序列表中SEQIDNO.1氨基酸序列的多核苷酸。含有上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。所述的重组表达载体为将权利要求2或3所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为大肠杆菌质粒pET28a(+)。上述的重组表达载体的制备方法为：采用权利要求2或3所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的核苷酸序列经EcoRI和XhoI双酶切后与EcoRI和XhoI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到重组表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase。所述的转基因重组菌是将权利要求5或6所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达，所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的核苷酸序列编码，实现在大肠杆菌中异源可溶性表达。上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的制备方法，培养含有D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的转基因细胞系或培养包含D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的重组表达载体转化的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物，得到粗酶，通过Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和柱纯化得到纯酶形式的目的蛋白。上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在水解D-乙酰氨基葡萄糖使其脱乙酰基制备氨基葡萄糖中的应用。上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在水解β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质使其脱乙酰基得到β-键连接的氨基葡萄糖中的应用。所述β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质优选为PNP-β-GlcNAc和X-β-GlcNAc。一种制备氨基葡萄糖或β-键连接的氨基葡萄糖的方法，是用上述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质使其脱乙酰基得到氨基葡萄糖或β-键连接的氨基葡萄糖。所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-键连接D-乙酰氨基葡萄糖的物质的反应条件为：反应温度为4～60℃，反应pH为7.0～10.5，反应底物的浓度为20～200mM；优选的：反应温度为42℃，反应pH为9.0，反应底物浓度为95.78mM，此时，反应速率达到最大。本专利技术涉及从一种海洋圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)中克隆的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶基因。所述编码序列如SEQNO.2所示。本专利技术还涉及包含所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码序列的重组表达载体，D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶基因的核苷酸序列经EcoRI和XhoI双酶切后与EcoRI和XhoI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase。本专利技术还制备包含本专利技术D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的转基因重组菌，将重组好的表达载体pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase转化到大肠杆菌BL21(DE3)，构成表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的转基因重组菌。将转基因重组菌通过正常的振荡培养，用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，通过超声裂解细胞，收获表达产物，表达产物利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化。对得到的纯化形式的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的活性条件进行优化，酶的活性受如底物特异性，pH，温度和金属离子等的影响。本专利技术中也对D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的活性进行这些方面的优化。本专利技术还对D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的应用进行简单涉及，利用核磁共振技术检测D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶在没有任何反应缓冲液和添加物的状态下的转化效率。其转化结果如图5所示。本专利技术的有益效果：本技术方案可以通过生物工程技术得到一种优质的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，实现D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源大量表达，底物特异性强，反应效率高，相比于化学法生产氨基葡萄糖，酶法生产将更具有极大的工业化潜力。附图说明图1为海本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种D‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的编码基因，其特征在于：该编码
基因具有下述核苷酸序列之一：
(1)序列表中的SEQIDNO.2的核苷酸序列；
(2)编码序列表中SEQIDNO.1氨基酸序列的多核苷酸。
3.含有权利要求2所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的重组表达载体、转
基因细胞系和转基因重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体为将权利
要求2或3所述的D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到
的表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为大
肠杆菌质粒pET28a(+)。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的制备方法
为：采用权利要求2或3所述D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶编码基因的核苷酸序列经EcoRI
和XhoI双酶切后与EcoRI和XhoI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到重组表达载体
pET28a(+)-N-acetylglucosaminedeacetylase。
6.根据权利要求3所述的转基因重组菌，其特征在于：所述的转基因重组菌是将权利
要求5或6所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达D-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰
基酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求1～6任意一项中所述的D-乙酰氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：弗戈迈·约瑟夫，刘丽，吕永梅，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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