本发明专利技术公开了一种生产L‑2‑氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用，所述重组菌为同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的菌株。本发明专利技术提供的以苏氨酸为底物生产L‑2‑氨基丁酸的重组菌显著提高了L‑2‑氨基丁酸的产量和底物转化率，有效降低了副产物的积累，并且简化了生产工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及生产L-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用。
技术介绍
L-2-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的脂肪族氨基酸，具有降低血氨，加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢等功能，临床可用于脑血管病后遗症的治疗和牙科的无痛去龋。此外，L-2-氨基丁酸还是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛应用于抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦等的合成。L-2-氨基丁酸的生产方法主要分为化学法、酶法和微生物发酵法。化学法主要包括脱硫反应法、正丁酸卤代反应法、丁酮酸还原法等。化学法研究起步较早，虽然工艺成熟，但化学合成法存在耗能高、环境污染大、生产成本高等缺点，不利于工业化应用；微生物发酵法指利用大肠杆菌等微生物直接发酵生产L-2-氨基丁酸。目前，国外对于微生物发酵法合成L-2-氨基丁酸的研究有一篇报道(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,107(14):6234-6239.)，该报道在传统诱变菌种大肠杆菌ATCC98082的基础上通过突变筛选谷氨酸脱氢酶及过表达苏氨酸脱氨酶构建了一株L-2-氨基丁酸的工程菌，但该工程菌L-2-氨基丁酸产量只有5.4g/L，与实现工业化应用存在较大差距。中国专利201210015308.4在苏氨酸高产菌株的基础上，通过过表达苏氨酸脱氨酶与氨基酸脱氢酶合成L-2-氨基丁酸，但该方法发酵60h，L-2-氨基丁酸产量只有20g/L，仍无法适应工业化生产需求；酶法制备L-2-氨基丁酸主要分为转氨酶法、脱氢酶法、氨基酰化酶法、氨基氧化酶法等。脱氢酶法是指2-酮丁酸在脱氢酶的催化作用下合成L-2-氨基丁酸。Galkin和Kulakova等利用大肠杆菌共表达L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，其中L-亮氨酸脱氢酶能够催化丁酮酸和NH3生产L-2-氨基丁酸，甲酸脱氢酶以甲酸铵为底物再生NADH，释放出二氧化碳和NH3(Applied and Environmental Microbiology,1997,63(12):4651-4656.)，此法生产L-2-氨基丁酸浓度达到36g/L，转化率大于80％。但该方法以2-酮丁酸为原料，大大提高了原料成本，导致生产成本较高，限制了该工艺的工业化应用。中国专利201210066624.4和201010139227.6等报道了以L-苏氨酸为原料，先由苏氨酸脱氨酶转化成2-酮丁酸，再由亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸，反应中加入辅酶再生体系。由于专利中所用酶催化剂需要克隆表达后经细胞破碎提取或直接购买，大大增加了生产成本，不利于推广应用。转氨酶法是指2-酮丁酸在转氨酶的催化作用下合成2-氨基丁酸(图1)。1999年，Fotheringham等利用大肠杆菌K12菌株过表达酪氨酸转氨酶、苏氨酸脱氨酶及乙酰乳酸合成酶，以L-苏氨酸和L-天冬氨酸为底物通过转氨反应合成了L-2-氨基丁酸，同时通过乙酰乳酸合成酶消除副产物丙酮酸(Bioorganic&Medicinal Chemistry,1999,7(10):2209-2213.)。但是该法生产L-2-氨基丁酸的转化率仅为54％，产量仅为27.8g/L，且转化过程中产生副产物NH3、L-丙氨酸和3-羟基-2-丁酮，由于L-2-氨基丁酸与副产物丙氨酸性质相似，导致该法制备的2-氨基丁酸纯化较为困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供能够提高L-2-氨基丁酸产量的重组菌及其制备方法，以及利用重组菌生产L-2-氨基丁酸的方法。为此，本专利技术一方面提供一种生产L-2-氨基丁酸的重组菌,所述重组菌为同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的菌株。在上述技术方案中，所述苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示，所述谷氨酸脱氢酶的氨基
酸序列为SEQ ID No.15所示；所述苏氨酸脱氨酶的基因序列为SEQ ID No.1中10～1554位或SEQ ID No.3中10～999位所示，所述转氨酶的基因序列为SEQ ID No.6中22～951位、SEQ ID No.8中15～1208位、SEQ ID No.10中9～1388位或SEQ ID No.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.14中177～1520位所示。在上述技术方案中，所述重组菌的出发菌为埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选为E.coli BL21(DE3)。本专利技术的另一方面，提供一种制备L-2-氨基丁酸重组菌的方法，包括如下步骤：同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶，得到所述重组菌。在上述技术方案中，所述过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶通过如下步骤实现：增加出发菌中苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的拷贝数。在上述技术方案中，所述方法进一步包括将所述出发菌的谷氨酸脱氢酶基因的启动子替换为具有更强转录活性的元件，和/或将所述出发菌的苏氨酸脱氨酶基因的核糖体结合位点替换为具有更强翻译活性的元件。所述更强转录活性的元件和更强翻译活性的元件可为任何转录活性较高的元件和任何翻译活性较高的元件，例如本专利技术中使用的RBS(SEQ ID No.4中33-39bp核苷酸序列)和强启动子T7(SEQ ID No.14中85-109bp核苷酸序列)。在上述技术方案中，通过携带所述苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的质粒转化所述出发菌来增加所述出发菌中苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的拷贝数；携带苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的表达质粒没有限制，可以是任何能够高效表达目的蛋白的质粒；优选地，所述质粒为pET28a。在上述技术方案中，所述苏氨酸脱氨酶的基因序列为SEQ ID No.1中10～1554位或SEQ ID No.3中10～999位所示，所述转氨酶的基因序列为SEQ ID No.6中22～951位、SEQ ID No.8中15～1208位、SEQ ID No.10中9～1388位或SEQ ID No.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.14中177～1520位所示。其中，所述苏氨酸脱氨酶选自但不限于大肠杆菌、芽胞杆菌，转氨酶选自但不限于大肠杆菌、芽胞杆菌。谷氨酸脱氢酶选自但不限于，大肠杆菌。所述大肠杆菌苏氨酸脱氨酶可以为合成型苏氨酸脱氨酶IlvA或分解型苏氨酸脱氨酶TdcB；所述芽胞杆菌苏氨酸脱氨酶可以为枯草芽胞杆菌苏氨酸脱氨酶IlvA。所述大肠杆菌转氨酶可以为支链氨基酸氨基转移酶IlvE、丙氨酸氨基转移酶AvtA、酪氨酸氨基转移酶TyrB、腐胺氨基转移酶PatA。所述芽胞杆菌转氨酶可以为支链氨基酸氨基转移酶IlvK、转氨酶PatA或磷酸丝氨酸氨基转移酶SerC。谷氨酸脱氢酶为大肠杆菌谷氨酸脱氢酶GdhA。在上述技术方案中，所述出发菌为选自埃希氏菌属的细菌，优本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产L‑2‑氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌为同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的菌株。
【技术特征摘要】
1.一种生产L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌为同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的菌株。2.如权利要求1所述的生产L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.15所示；所述苏氨酸脱氨酶的基因序列为SEQ ID No.1中10～1554位或SEQ ID No.3中10～999位所示，所述转氨酶的基因序列为SEQ ID No.6中22～951位、SEQ ID No.8中15～1208位、SEQ ID No.10中9～1388位或SEQ ID No.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.14中177～1520位所示。3.如权利要求1所述的生产L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌为埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选为E.coli BL21(DE3)。4.一种制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶，得到所述重组菌。5.如权利要求4所述的制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，所述过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶通过如下步骤实现：增加出发菌中苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的拷贝数。6.如权利要求5所述的制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将所述出发菌的谷氨酸脱氢酶基因的启动子替换为具有更强转录活性的元件，和/或将所述出发菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：温廷益，温际富，梁勇，张芸，刘树文，商秀玲，邓爱华，刘茜，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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