一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术公开的光合固氮工程菌，其制备方法包括：对受体菌进行包括1)与2)的改造，得到重组菌：1)使受体菌中NifA蛋白质具有活性；2)包括2A)或2B)：2A)将受体菌基因组中铁固氮酶anfH启动子替换为钼固氮酶nifH启动子；2B)将受体菌基因组中AnfA基因和铁固氮酶anfH启动子替换为钼固氮酶nifH启动子。本发明专利技术得到的光合固氮工程菌突破了铵抑制等调控限制，实现了铁固氮酶的组成型表达，大大缩短了培养铁固氮酶表达菌的生长周期，显著提高了铁固氮酶的产量，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域中，一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

1、固氮酶根据其活性中心的金属辅因子分为钼固氮酶、钒固氮酶和铁固氮酶。鉴于我国农耕用地普遍缺乏有效态钼，而钒离子是有毒金属离子，表达铁固氮酶的固氮菌在农业可持续发展中具有开发为微生物菌剂等产品的潜力。除此之外，固氮酶在固氮时可以产生清洁能源氢气，铁固氮酶还能够将二氧化碳还原为生物燃料甲烷，因此铁固氮酶在能源生产等领域也发挥着重要作用。

2、铁固氮酶的表达由于受到诸多限制而未能实现大量生产，其中最主要的限制因素是铁固氮酶的表达受到环境中固定态氮的抑制，阻碍了固氮菌在普遍含有铵的环境中的应用。在不含铵的条件下，表达铁固氮酶的菌株生长周期长(生长至稳定期约5-7天)，细胞密度(培养菌液od660最高达到0.7-1.0左右)和产量都非常低。并且铁固氮酶的表达同时受到钼离子或有活性的钼固氮酶的抑制。因此解除抑制或者避开调控通路，实现铁固氮酶在自生固氮菌中组成型表达，是提高菌密度、生长速度以及固氮速率的有效途径，有助于实现表达铁固氮酶的自生固氮菌的广泛应用。

3、沼本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种重组菌的制备方法，包括：对受体菌进行包括如下1)与2)的改造，得到重组菌：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)通过a)使SEQ ID NO.2所示NifA蛋白质的第202-217位氨基酸的缺失突变，或b)使所述NifA蛋白质的第202、209、212、213位氨基酸饱和突变，或c)使所述NifA蛋白质的第202、209、212和/或213位氨基酸突变实现，或使与所述NifA蛋白质的同源蛋白质的同源位置发生a)或b)或c)的突变实现；

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在...

【技术特征摘要】

1.一种重组菌的制备方法，包括：对受体菌进行包括如下1)与2)的改造，得到重组菌：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)通过a)使seq id no.2所示nifa蛋白质的第202-217位氨基酸的缺失突变，或b)使所述nifa蛋白质的第202、209、212、213位氨基酸饱和突变，或c)使所述nifa蛋白质的第202、209、212和/或213位氨基酸突变实现，或使与所述nifa蛋白质的同源蛋白质的同源位置发生a)或b)或c)的突变实现；

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对所述受体菌进行3)的改造：

【专利技术属性】
技术研发人员：郑艳宁，曾艳，崔玲炜，王孟寐，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：