【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域和生物农药领域，涉及一种提高白僵菌毒力的方法、一种过表达bps8和ribotoxin基因的白僵菌工程菌。
技术介绍
1、由于化学农药的大量使用对环境生态造成了严重的影响，生物防治日益受到重视，利用昆虫病原体防治害虫是生物防治的重要手段。昆虫病原体包括细菌、真菌、支原体或病毒，可以感染昆虫和其他节肢动物并随后引起疾病。它们可以作为昆虫和螨类害虫的天然抑制剂，间接影响种植系统。当发生流行病暴发时，昆虫病原体能够导致其节肢动物宿主的大量种群迅速减少。许多这些天然存在的病原体已被配制并商业化为杀虫剂。在昆虫病原体中，真菌作为生物杀虫剂引起了研究和使用的最大兴趣。
2、昆虫病原真菌作为一种常用的生物防治菌种，已被广泛应用于害虫防治，目前已有很多成功的案例，金龟子昆虫病原真菌(metarhiziumanisoliae)、黄绿昆虫病原真菌(m.flavoviride)和罗伯特昆虫病原真菌(m.robertsii)等菌种对葡萄黑象甲(otiorhynchussulcatus)、蟋蟀(anabrussimplex)、小菜蛾(plutellaxylostella)、灰飞虱(laodelphaxstriatellus)等鞘翅目、直翅目、鳞翅目、半翅目的昆虫皆有侵染作用。cn112205422a报道了昆虫病原真菌马昆德马昆德菌(marquandomyces marquandii)可高效地杀死双斑长跗萤叶甲(monoleptahieroglyphica)、绿豆象(callosobruchus chinensis)和玉
3、真菌杀虫剂是利用昆虫病原真菌活体或其来源的活性成分加工而成的生物制剂，在害虫生物防治中发挥重要的作用。杀虫真菌具有防治范围广、持续控制期长，能够扩散流行，且大多数真菌对人畜无害，不污染环境等优点在害虫防治中发挥独特的作用。但真菌杀虫剂具有杀虫速率慢和防治效果不稳定等缺点，是真菌杀虫剂广泛应用的重要限制因素。因此，有效地改良杀虫真菌，提高菌株的杀虫效率和环境适应性具有重要的生产应用意义。因此通过基因遗传改造来提高杀虫真菌的防治效率显得十分必要。
技术实现思路
1、球孢白僵菌(beauveria bassiana)作为子囊菌门代表性的模式病原真菌，对宿主昆虫具有体表附着、体壁穿透、体内定殖和致死等经典的侵染循环。专利技术人通过基因工程对杀虫真菌进行改良，采用源于植物细胞转化的根癌农杆菌介导的遗传转化方法(agrobacterium tumefaciens mediated transformation,atmt)，把来源于白僵菌自身的、可以破坏宿主免疫反应的基因bps8和ribotoxin转入野生型白僵菌中，持续过表达的工程菌株，提高了白僵菌杀虫效率，克服真菌杀虫效果慢、受环境影响大和效果不稳定等缺点，使真菌杀虫剂替代化学杀虫剂在农业生产中广泛应用成为可能，对农业增产、增收和环境保护具有重要意义。具体地，本专利技术的技术方案如下所述。
2、一种提高白僵菌毒力的方法，包括以下步骤：以为白僵菌底盘细胞，使其基因组中发生如下方式改变；
3、a.将来源于白僵菌的可以破坏宿主免疫反应的基因bps8克隆入白僵菌基因组，筛选毒力增强的阳性克隆株；
4、b.将来源于白僵菌的可以破坏宿主免疫反应的基因ribotoxin克隆入白僵菌基因组，筛选毒力增强的阳性克隆株；或者
5、c.将来源于白僵菌的基因bps8和ribotoxin一起转入白僵菌基因组，筛选阳性克隆株。
6、上述底盘细胞可以是白僵菌分生孢子，也可以是菌丝体或者原生质体细胞。
7、在一种实施方式中，上述白僵菌是球孢白僵菌beauveria bassiana arsef 2860。
8、优选地，上述基因bps8核苷酸序列为seq id no:1(ncbi登录号bba_00319)，所述基因ribotoxin的核苷酸序列为seq id no:2(ncbi登录号bba_01016)。
9、上述方法中，可以通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法(agrobacteriumtumefaciens mediated transformation,atmt)将表达基因bps8和ribotoxin的质粒分别转入白僵菌底盘细胞中；
10、也可以将共表达基因bps8和ribotoxin的质粒直接转入白僵菌底盘细胞中；
11、还可以通过基因编辑技术将基因bps8和ribotoxin转入白僵菌底盘细胞中。所述基因的转入还可以通过基因编辑技术实施，所述基因编辑技术选自下组：同源双交换，talen系统，crispr-cas9系统，crispr-cpf1系统，crispr-cas12系统，crispr-best系统，mugent(multiplex genome editing by natural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)，crispri。
12、在上述根癌农杆菌介导的将共表达基因bps8和ribotoxin的质粒直接转入方法中，可以将基因bps8和ribotoxin克隆在带有pdga强启动子的过表达载体(pdht-ben-gpda，其含有苯菌灵抗性基因，并带有构巢曲霉3’-磷酸甘油醛脱氢酶启动子pgpda，用于真菌过表达)上，得到用于过表达基因bps8和ribotoxin的质粒pdht-ben-gpda-bps8-ribotoxin。
13、优选地，上述带有pdga强启动子的过表达载体(pdht-ben-gpda，带有pdga强启动子、苯菌灵抗性基因)上还带有草胺膦抗性(bar)基因作为筛选标记。
14、本专利技术的第二个方面提供了一种共表达基因bps8和ribotoxin的质粒pdht-ben-gpda-bps8-ribotoxin，其核苷酸序列可以为seq id no:3。该质粒可以用于构建其他防治病虫害的微生物、尤其是真菌。
15、本专利技术的第三个方面提供了一种白僵菌工程菌，其按照上述的方法构建得到。
16、上述构建得到的白僵菌工程菌可以用于防治病虫害，比如用于杀灭鳞翅目昆虫和大蜡螟。
17、本专利技术以球孢白僵菌野生型菌株beauveria bassiana arsef 2860作为基础菌株，通过农杆菌介导的真菌转化方法将bps8和ribotoxin基因转入野生型白僵菌菌株基因组中，构建了bps8和ribotoxin基因过表达的重组工程菌。构建的过表达白僵菌转基因菌株对鳞翅目昆虫家蚕和大蜡螟效果好，毒力较原有菌株显著增强。
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1.一种提高白僵菌毒力的方法，其特征在于，包括以下步骤：以白僵菌为底盘细胞，使其基因组中发生如下方式改变；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底盘细胞是白僵菌分生孢子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述白僵菌是球孢白僵菌Beauveriabassiana ARSEF 2860。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因BPS8核苷酸序列为SEQ ID NO:1，所述基因Ribotoxin的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法将表达基因BPS8和Ribotoxin的质粒分别转入白僵菌底盘细胞中；或者将共表达基因BPS8和Ribotoxin的质粒直接转入白僵菌底盘细胞中；或者通过基因编辑技术将基因BPS8和Ribotoxin转入白僵菌底盘细胞中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在共表达基因BPS8和Ribotoxin的质粒直接转入方法中，将基因BPS8和Ribotoxin克隆在带有pdgA强启动子的过
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述带有pdgA强启动子的过表达载体上还带有草胺膦抗性基因作为筛选标记。
8.一种共表达基因BPS8和Ribotoxin的质粒pDHt-Ben-gpdA-BPS8-Ribotoxin，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
9.一种白僵菌工程菌，其特征在于，按照如权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到。
10.如权利要求9所述的白僵菌工程菌在防治病虫害中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高白僵菌毒力的方法，其特征在于，包括以下步骤：以白僵菌为底盘细胞，使其基因组中发生如下方式改变；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底盘细胞是白僵菌分生孢子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述白僵菌是球孢白僵菌beauveriabassiana arsef 2860。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因bps8核苷酸序列为seq id no:1，所述基因ribotoxin的核苷酸序列为seq id no:2。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法将表达基因bps8和ribotoxin的质粒分别转入白僵菌底盘细胞中；或者将共表达基因bps8和ribotoxin的质粒直接转入白僵菌底盘细胞中；或者通过基因编辑技术将基因bps8和ribotoxin...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄武仁，魏雪菲，汤莹钰，凌尔军，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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