本发明专利技术公开了一株重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CEBO86，是将构建的重组质粒pACT3‑PglB和pBAD24‑malEM共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中获得，该重组大肠杆菌的基因型为CLM24/p‑pglB+p‑malEM，有能同时表达PglB和malEM基因的功能。利用本发明专利技术所述重组大肠杆菌能够发酵制备具有人血型B抗原活性的N‑糖蛋白，且生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可实现N‑糖蛋白的大规模生产；制备获得的N‑糖蛋白具有良好的B抗原活性，可高效吸附人血浆中的抗B抗体，为通用血产品的制备提供新的选择方案，同时，可用于血型不兼容的器官移植，具有良好的工业开发和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株重组大肠杆菌及其应用，尤其涉及一株重组大肠杆菌CEBO86及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用；属于生物技术、基因工程和微生物发酵领域。
技术介绍
ABO血型系统是人类血型系统中最重要的一类。根据红细胞所含的特殊的抗原不同，该系统分为A、B、AB和O四种血型。该血型系统是由A、B两种抗原决定，它们是一种多糖抗原，在血小板以及内皮细胞上有分布。血型不相容是因为人体内产生有相应的抗体来对抗A或B抗原。这些抗体就像血凝素，它们能够引起血细胞凝集而消融，在大量输血或者进行器官移植过程甚至会造成死亡。移除血浆里的抗A或B抗体可克服因为不同血型之间进行的器官移植而引起的超敏排斥，因此，适时移除血浆里的抗A或B抗体是一种有效并切实可行的抗凝集和排异方法。目前，已有多种方法可去除血浆中抗A或抗B抗体，其主要根据这些抗体与相应抗原的特异性结合，利用免疫吸附的方式除去相应的抗体或者是抗体生成细胞，可用于ABO血型不合型的器官移植。常用的免疫吸附是将A或B血型抗原通过配糖类物质连接到琼脂糖基质上。值得一提的是，A或B血型抗原不仅仅很难获取，而且很难固定化，使得整个方法造价相当昂贵以致不能在资源匮乏、收入低下的国家得到很好地应用。因此亟需找到一种费用低、效率高的具有人血型抗原活性的糖抗原的生产方法。目前，A、B血型抗原多数都是通过化学方法和生物酶法合成。其血型抗原糖链的化学合成不仅需要复杂的保护和去保护的操作，步骤繁杂，立体专一性不易控制，而且产率低。同时酶法合成中所用的相关糖基转移酶较难大批量获取，并且，酶促反应中活化的糖供体价格昂贵，这为血型糖抗原的酶法合成增加了困难。经检索，利用重组大肠杆菌制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白(大肠杆菌O86:H7N-糖蛋白)以及利用N-糖蛋白在去除血浆B抗体中的应用的文献还未见报道。
技术实现思路
针对现有方法的不足，本专利技术要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用。研究证明，大肠杆菌O86:B7的O抗原与人B血型抗原结构相似，具有人B血型抗原活性(图1)。本专利技术的技术方案基于空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途径相似的特点，采用在大肠杆菌O86:H7中过量表达来源于大肠杆菌中的malE基因(来源NEB公司的质粒pMAL-p5X)突变体和来源于空肠弯曲菌的pglB基因(PglB NCBI-GeneID:905417)，构建获得基因型为O86Δwaal/p-malEM+p-PglB的重组大肠杆菌，并且在改良LB培养基中发酵生产具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白。本专利技术所述的重组大肠杆菌菌株命名为重组大肠杆菌CEBO86，其特征在于：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：构建含有PglB基因的pACT3-PglB的重组质粒和含有malEM基因的pBAD24-malEM的重组质粒，然后将上述构建的重组质粒pACT3-PglB和pBAD24-malEM共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达PglB和malEM基因的重组大肠杆菌，其基因型为CLM24/p-pglB+p-malEM，该菌株即为重组大肠杆菌CEBO86；其中，所述malEM基因来源于质粒pMAL-p5X，所述PglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTC 11168；上述malEM基因为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的表达糖基化序列的基因所得；上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌O86的waaL基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为O86Δwaal。进一步的，上述重组大肠杆菌CEBO86的构建方法概述：1.waaL基因的敲除基本方法是通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli O86中敲除基因waaL(寡糖基转移酶)。制得的缺失waaL基因的大肠杆菌E.coli O86Δwaal，命名为CLM24。上述Red重组系统，是通过质粒pKD46表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo，通过设计带有waaL基因同源臂的引物扩增带有筛选标记卡那霉素抗性基因的重组片段。然后通过电穿孔仪电击，将重组片段转入表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo的大肠杆菌中，重组片段在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原有的基因置换下来，而抗性基因通过表达FLP内切酶，从基因组上切除掉。2.malEM基因和PglB基因表达载体的构建基本方法是以空肠弯曲菌基因组为模板，克隆pglB基因，将所克隆获得的pglB基因插入质粒pACT3中，从而获得重组表达载体p-pglB；以质粒pMAL-p5X为模板，克隆malEM基因，将所克隆获得的malEM基因插入质粒pBAD24中，从而获得重组表达载体p-malEM。3.N-糖蛋白发酵重组菌株的构建基本方法是将所构建的重组质粒p-pglB和p-malEM共转化大肠杆菌CLM24中，从而获得过量表达malEM和pglB基因的重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CEBO86。本专利技术所述重组大肠杆菌CEBO86在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用。具体的，利用重组大肠杆菌CEBO86制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白的方法是：1.摇瓶培养挑取所构建的重组菌株CEBO86单菌落置装有3-5mL改良LB培养基的15mL的试管中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，在37℃，200-225r/min，培养12h。将过夜培养的菌液按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有50mL改良LB培养基的100mL的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为25μg/mL，在37℃，200-225r/min条件下培养。待菌液OD600＝0.4-0.6时，按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有1L改良LB培养基的3L的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为25μg/mL，在37℃，200-225r/min条件下培养。待菌液OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.2％(v/v)的L-阿拉伯糖和终浓度为100mM/L的IPTG，在16-37℃，200-225r/min条件下培养。其中，上述加入L-阿拉伯糖后，发酵温度优选28℃。待培养4-6h后，补加一次终浓度为0.2％(v/v)的L-阿拉伯糖，在200-225r/min，28℃继续培养14-16小时。2.N-糖蛋白纯化将摇瓶发酵的菌液以10,000-12,000r/min离心5-10min。离心所得沉淀用1mg/ml溶菌酶4℃处理1h。再以10,000-12,000r/min离心5-10min，收集上清用亲和镍柱纯化，收集N-糖蛋白的洗脱液，超滤脱盐。检测结果：摇瓶发酵中N-糖蛋白的产量为1.5mg/L。本专利技术公开了一株重组大肠杆菌CEBO86及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用，利用本专利技术提供的重组大肠杆菌发酵制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白的生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可以应用于具有人血型B抗原的N-糖蛋白的大规模生产；同时，本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株重组大肠杆菌，该菌株命名为重组大肠杆菌CEBO86，其特征在于：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：构建含有PglB基因的pACT3‑PglB的重组质粒和含有malEM基因的pBAD24‑malEM的重组质粒，然后将上述构建的重组质粒pACT3‑PglB和pBAD24‑malEM共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达PglB和malEM基因的重组大肠杆菌，其基因型为CLM24/p‑pglB+p‑malEM，该菌株即为重组大肠杆菌CEBO86；其中，所述malEM基因来源于质粒pMAL‑p5X，所述PglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTC 11168；上述malEM基因为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的表达糖基化序列的基因所得；上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌O86的waaL基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为O86Δwaal。
【技术特征摘要】
1.一株重组大肠杆菌，该菌株命名为重组大肠杆菌CEBO86，其特征在于：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：构建含有PglB基因的pACT3-PglB的重组质粒和含有malEM基因的pBAD24-malEM的重组质粒，然后将上述构建的重组质粒pACT3-PglB和pBAD24-malEM共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达PglB和malEM基因的重组大肠杆菌，其基因型为CLM24/p-pglB+p-malEM，该菌株即为重组大肠杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，刘现伟，商文静，翟亚菲，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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