鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品技术

本发明专利技术公开了一种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品。本发明专利技术根据病毒流行趋势预测将鸡新城疫病毒F基因以及HN基因进行优化。本发明专利技术进一步将鸡新城疫病毒糖蛋白抗原基因、优化后的抗原基因或串联的优化抗原基因组合在家蚕生物反应器中进行表达，所表达的抗原或制备的重组病毒能为动物提供有效的免疫保护。本发明专利技术还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因呈递载体的制备方法，包括：将鸡新城疫病毒抗原优化基因或串联的优化抗原基因组合克隆进哺乳动物启动子控制的杆状病毒运载载体中，重组得到含哺乳动物启动子控制的基因呈递载体；通过注射或口服等方式将其进入到动物体内后，能在动物体内高效呈递抗原基因，有效抵御新城疫病毒的攻击。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为“201410196203.2”，申请日为“2014年5月9日”，专利技术名称为“鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，尤其涉及利用重组杆状病毒在昆虫体内制备鸡新城疫病毒抗原的方法以及由该制备方法得到重组抗原，本专利技术还涉及一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法及其产品，本专利技术进一步涉及它们在预防、治疗或诊断鸡新城疫疫苗或试剂中的用途，属于鸡新城疫病毒抗原的制备和应用领域。
技术介绍
新城疫于1926年首先发现于印度尼西亚，同年发现于英国的新城，由于新城疫危害严重，国际兽疫局(OIE)把新城疫定为烈性传染病，给养殖业带来巨大经济损失。世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病。因此，寻找一种理想的免疫保护性抗原用于该病的快速诊断与免疫防治十分迫切。随着杆状病毒作为载体，在体外和体内转导动物细胞并获得目的蛋白的高效表达，杆状病毒日益显示了其作为非复制型载体在基因治疗中的应用前景，开辟了杆状病毒应用研究的新领域(HiiserA.AmJPharmacogenomies,3(1):53-63,2003)。从杆状病毒表达系统建立以来，已有1000多种外源基因在这一系统中得到了表达。1985年，Maeda用家蚕BombyxmoriNPV作表达载体，在家蚕体内高水平地表达出人α干扰素以来，以中国和日本为代表的有蚕国家，不断发展家蚕杆状病毒表达系统，已成为比较成熟的一种蛋白表达技术(吕鸿声.昆虫病毒分子生物学免疫研究,1998)。与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比，家蚕杆状病毒表达系统在一定方面具有许多优势，因此充分利用家蚕资源来生产外源蛋白，对生物医药产业具有重要意义。但是，至今尚无利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内成功表达鸡新城疫病毒抗原的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内表达鸡新城疫病毒抗原的方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：本专利技术提供了一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒；(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞，诱导表达相应的鸡新城疫病毒抗原；收获并纯化所表达的抗原。本专利技术还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒，将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞扩增重组杆状病毒，即得。所述鸡新城疫病毒基因F的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示；优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，其氨基酸序列为SEQIDNO.6所示；所述鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，其氨基酸序列为SEQIDNO.4所示；所述优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.8所示；所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列(F-IRES-HN-O)为SEQIDNO.9所示。所述的杆状病毒运载载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG,pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV,pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，优选为pVL1393杆状病毒运载载体。所述的哺乳动物细胞启动子包括但不限于CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶l基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子、鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CA本文档来自技高网...

【技术保护点】
预测后优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因HN‑O，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

【技术特征摘要】
1.预测后优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因HN-O，其特征在于：其核苷酸序列为
SEQIDNO.7所示。
2.含有权利要求2所述优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因HN-O的表达载体；优选
的，所述的表达载体是杆状病毒表达载体。
3.一种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O克隆到杆状病毒运
载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城
疫病毒的糖蛋白基因F-O与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或权利要求1所述的优
化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载
载体中，构建得到转移表达载体；
(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞，诱
导表达相应的鸡新城疫病毒抗原；收获并纯化所表达的抗原。
4.一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法，其特征在于，包括
以下步骤：
(1)将权利要求1所述的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O与哺乳动物细胞启
动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将优化后的鸡新城疫
病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的
序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；
(2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；
(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主，扩增重组杆状病毒，即得。
5.按照权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述优化后的鸡新城疫病毒血凝
素神经氨酸酶基因HN-O为SEQIDNO.7所示；所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O
与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列为SEQIDNO.9所
示。
6.按照权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述的杆状病毒运载载体选自
AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、
p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、
pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP
25、pAcRW4、pAcsMAG,pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、
pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、
pBlueBacIII、pBlueBacH...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志芳，李轶女，王智权，易咏竹，李浩洋，李田田，胡小元，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11