本发明专利技术公开了一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白及应用，所述的抗原蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。利用本发明专利技术提供的蛋白，无菌处理后与佐剂按比例混合，肌肉免疫仔猪，发现其可有效提供攻毒后仔猪存活率，加快仔猪恢复速度；安全性试验证实，无论是断奶仔猪还是妊娠期母猪免疫后，均无不良反应；免疫期长，对多种血清型的丹毒丝菌均有良好防效，因此极具市场开发潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及家畜基因工程疫苗领域，具体涉及一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白及应用。技术背景猪丹毒是上世纪90年代猪三大传染病之一，随着弱毒和商业化疫苗的使用逐渐得到了有效的控制。但2010年以来，猪丹毒在我国部分省市发生流行。2012年猪丹毒病例已逐渐增多，至2013年，在我国湖南、湖北、江西、广西、四川、广东、浙江等多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行，给猪场造成了巨大的经济损失。以往青霉素是可以作为特效药来治疗猪丹毒的，世界上也没发现一株耐青霉素的红斑丹毒丝菌。然而，湖南动物疾病中心何世成等人在这次猪丹毒爆发中分离到了进行3株耐青霉素红斑丹毒丝菌。本实验室对湖北地区的临床分离红斑丹毒丝菌的耐药性分析表明，对常用的卡那霉素、链霉素、阿米卡星、多粘菌素B、万古霉素、庆大霉素6种抗生素耐药率为100％。目前已有足够的流行病学资料证实，红斑丹毒丝菌已经对我国的养殖业和人民健康构成了严重的威胁。红斑丹毒丝菌商业化疫苗主要有灭活疫苗C43-5、弱毒疫苗G4T10和GC42。使用灭活疫苗对同源的红斑丹毒丝菌具有较好的免疫保护，但由于不同菌株的毒力基因表型存在较大差异，对于异源菌株的保护力不佳，免疫持续期可达6个月。猪丹毒弱毒苗用于3月龄以上的猪，免疫后7d产生免疫力，可持续6个月。弱毒疫苗可使猪得到保护，但不能清除定居在扁桃体或关节里的红斑丹毒丝菌,也不能清除隐性感染猪扁桃体内的细菌。另外，母源抗体和药物很容易干扰疫苗的效力，如果弱毒活菌株返毒，其对易感猪群存在很大的风险。鉴于此，本专利技术着手于红斑丹毒丝菌保护性抗原的研究，寻找能提供高效免疫力、生物安全好的抗原成分，保护猪抵抗流行毒株的侵袭。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白，其序列为SEQIDNO.2所示。其对应的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术最后一个目的在于提供了一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白在制备猪丹毒疫苗中的应用，该蛋白无菌处理后与佐剂按比例混合，肌肉免疫仔猪，发现其可有效提供攻毒后仔猪存活率，加快仔猪恢复速度。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白，其序列为SEQIDNO.2所示。可利用常规方案，例如合成，原核表达等方式获得该蛋白。SEQIDNO.2所示氨基酸序列对应的核苷酸序列也为本专利技术的保护范围，优选的所述的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白在制备猪丹毒疫苗中的应用，包括利用该蛋白无菌处理后与佐剂按比例混合，制备为猪丹毒疫苗；或是该疫苗与其他已知疫苗组合制备为多联疫苗。与现有疫苗相比，本专利技术具有以下优点：弱毒苗存在毒力返强的危险，会对易感猪群造成巨大的威胁，而且毒力减弱的机理不是很清楚。灭活苗可以为同源红斑丹毒丝菌提供较好的保护效果，但不同菌株的毒力基因存在差异，其对异源菌株的保护效果很弱。本专利技术提供的亚单位疫苗具有好的保护效果，生物安全性高。附图说明图1为实施例1中制备的PotA蛋白检测示意图。图1A重组抗原纯化SDS-PAGE电泳；图1BWestern-blot分析示意图。图2重组抗原PotA蛋白免疫小鼠后的抗体水平。图3重组抗原PotA蛋白诱导小鼠抗体IgG亚类测定。图4抗原PotA蛋白免疫小鼠后2LD100攻毒保护力效果试验。图5PotA免疫仔猪后体温变化。图6PotA免疫仔猪后血清特异性抗体水平变化规律。图7PotA免疫仔猪后3LD100攻毒保护力试验具体实施方式本专利技术所述试剂如未特别说明，均购自商业渠道或为本领域的常规配制试剂。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。实施例1：红斑丹毒丝菌抗原蛋白(本专利技术或称PotA蛋白)的制备：本专利技术实施例以原核表达为例，对该蛋白的的获得进行说明：大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pET-28a-PotA的构建，表达并纯化目的蛋白1)构建表达载体利用BamHI+HindⅢ购自宝生物(大连)有限公司产品)同时酶切PCR扩增的PotA基因片段(SEQIDNO.1所示)和pET-28a(+),回收PCR片断以及表达载体质粒，将酶切后PotA基因片段与酶切后pET-28a(+)连接，构建出pET-28a-PotA。转化到DH5a感受态，利用BamHI+HindⅢ酶切提取的质粒pET-28a-PotA,酶切后应出现预期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。重组质粒pET-28a-PotA的双酶切鉴定结果见图2，双酶切的条带符合PotA的大小。将重组质粒pET-28a-PotA转化至感受态细胞BL-21(DE3)，采用菌落PCR的方法，挑选阳性克隆扩大培养，提取质粒双酶切鉴定同时将质粒送上海生工生物公司测序，比对正确，即为PotA的表达菌株。2)表达、纯化目的蛋白将大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pET-28a-PotA接种于含有25μg/mlKan的3mLLB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含有25μg/mlKan的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD600达到0.8时，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L，继续培养3h后收集菌体。将诱导后的重组大肠杆菌8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mMTris-HCl(pH8.0)重悬，并加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，12000r/min，离心30min。将沉淀用2M尿素洗俩次，用8M尿素重悬沉淀，放入透析袋中，进行梯度透析，直至透析袋中的缓冲液完全替换成50mMTris-HCl(pH8.0)，重组抗原蛋白PotA(包括SEQIDNO.2所示序列)进行SDS-PAGE电泳分析及纯化结果见图1A，条带符合PotA蛋白的大小40KD。用Western-blot方法(见上述《分子克隆手册》)分析重组抗原蛋白PotA的免疫原性，结果如图1B所示PotA蛋白可以和PotA免疫鼠阳性血清发生特异性反应，是一个十分重要的保护性抗原，用于以下实施例。实施例3：亚单位疫苗成分及常规检验1)疫苗成分：PotA蛋白溶液、佐剂(武汉科前生物有限责任公司)疫苗乳化：PotA蛋白与佐剂按1：1体积混合乳化。使抗原蛋白的终浓度为1mg/ml，用于以下实施例。2)常规检验：疫苗性状检测：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散开，第二滴油珠状，晃动液面油珠不破乳。无菌检测：取本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序...
【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，李敬涛，王雅，康超，孙小美，朱伟峰，吴超，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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