本发明专利技术属于疫苗制备技术领域，具体公开了阴道毛滴虫α-actinin重组融合蛋白免疫保护性抗原、疫苗和应用；利用原核表达体系构建了可以大量稳定表达α-actinin亚片段的表达菌株，同时纯化并获得ACT-T蛋白，该蛋白作为抗原免疫感染阴道毛滴虫的小鼠后，小鼠在14天后基本痊愈，对小鼠的免疫保护作用接近100%，将ACT-T融合蛋白作为抗原制成亚单位疫苗，从而实现对小鼠的免疫保护，该疫苗具有广泛的开发应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗制备
，更具体地，涉及阴道毛滴虫a-actinin重组融合 蛋白免疫保护性抗原、疫苗和应用。
技术介绍
阴道毛滴虫是一种寄生于人体泌尿生殖系统的原虫。感染该虫之后会引起女性阴 道炎、尿道炎、子宫颈炎；男性感染阴道毛滴虫后，发生前列腺癌的概率也比正常人群要高； 阴道毛滴虫感染还会增加人群感染乙肝病毒、人型支原体以及艾滋病病毒的风险，也会引 起孕妇早产以及新生儿体重偏轻，并且有可能在阴道分娩过程中传播给新生儿呼吸道。 阴道毛滴虫病呈全球分布，是最常见的非病毒性性传播疾病。然而由于缺乏对该 病的充分认识和筛查计划，导致全球上百万病例未得报道及诊断，致使该病成为一种被忽 视的性传播疾病。根据WHO评估，2008年全世界15至49岁年龄段的人群中，感染毛滴虫的 患者约为2. 764亿。相比2005年同年龄段的感染人数2. 485亿，已上涨了 11. 2%。此外，虽 然甲硝唑是目前治疗阴道毛滴虫感染的首选药物，然而，近年来除了逐渐发现甲硝唑有毒 副作用以外，临床上还发现了不少甲硝唑的抗性株。由于阴道毛滴虫主要通过性接触直接 传播，患者尤其是男性患者感染毛滴虫后又常为无临床症状的带虫者，可能导致其伴侣反 复感染，导致交叉感染，扩大传播。因此，发展可持续控制的策略，例如疫苗的开发，就变得 很有意义。而目前对于毛滴虫疫苗相关的研究非常有限。目前仅有研究人员用全虫为疫苗， 或以阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白CP62为疫苗，接种小鼠鼻腔，在小鼠的毛滴虫感染阴道模型 中都有一定的保护作用。然而，与大分子抗原相比，在亚单位疫苗中，由于分子相似性而引 起的自体免疫的可能性更小，因此开发亚单位疫苗更安全。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供阴道毛滴虫 a-actinin重组融合蛋白免疫保护性抗原。 本专利技术的第二个目的是提供阴道毛滴虫a-actinin重组融合蛋白免疫保护性疫 苗。 本专利技术的第三个目的是提供上述免疫保护性抗原或疫苗的应用。 本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的： a-actinin重组融合蛋白ACT-T作为阴道毛滴虫病免疫保护性抗原的应用，其ACT-T的氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。 阴道毛滴虫a-actinin蛋白是一种结合于actin，分子大小为115Kda的蛋白，也 是阴道毛滴虫细胞骨架重排中比较活跃的蛋白之一。该蛋白参与毛滴虫阿米巴形变，被认 为与虫株毒力相关；并且阴道毛滴虫中最常见的免疫原就是a-actinin，可以引起了强烈 的体液免疫反应，经常被发现存在于裂解的靶细胞表面。由于该蛋白强的抗原性及免疫原 性，而a-actinin全基因较长，那么包含蛋白中间区域的核心抗原决定簇的亚克隆，贝1J成 为设计毛滴虫诊断与疫苗的良好选择。为获取大量纯化的目的蛋白，本研究利用BL21原核 表达体系构建了可以大量稳定表达a -actinin亚片段的表达菌株，进行疫苗相关的研究。 由于a-actinin全长序列较长，在进行原核表达时多数表达为包涵体，申请人 前期研究中构建了3段序列，分别是a-actinin全长序列、涵盖中间核心抗原决定簇的 a -actinin全长序列前半段(ACT-F)和涵盖中间核心抗原决定簇的a -actinin全长序列 后半段(ACT-T);分别将这3段序列构建表达载体进行原核表达，虽然这三段序列获得的重 组蛋白均具有免疫表现，但作为免疫原对动物进行免疫时，其免疫保护作于差别显著。 申请人研究发现适当浓度的重组融合蛋白免疫感染阴道毛滴虫的小鼠后，其中 ACT-T的免疫保护作于尤其明显，接近100%，因此ACT-T是制备阴道毛滴虫病疫苗理想的候 选抗原。 本专利技术还提供a-actinin重组融合蛋白ACT-T在制备治疗阴道毛滴虫病的制剂 方面的应用，其ACT-T的氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。 本专利技术还提供a-actinin重组融合蛋白ACT-T在制备预防阴道毛滴虫病的制剂 方面的应用，其ACT-T的氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。 优选地，本专利技术所述ACT-T的核苷酸序列如SEQIDN0 :2所示。 本专利技术还提供一种阴道毛滴虫a-actinin重组融合蛋白疫苗，所述疫苗含有上 述a-actinin重组融合蛋白ACT-T。 本专利技术所述ACT-T作为抗原免疫感染阴道毛滴虫的小鼠后，小鼠在14天后基本痊 愈，本专利技术所述疫苗执行了主动免疫，抗原注入阴道毛滴虫的小鼠后，体内发生了复杂的免 疫保护过程，从而最终实现对小鼠的免疫保护。 优选地，本专利技术所述疫苗还包括制备疫苗所需的辅剂。 更优选地，所述辅剂为免疫佐剂。 更优选地，所述a -actinin重组融合蛋白ACT-T的用量为20~100 ug。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果： 本专利技术提供了阴道毛滴虫a-actinin重组融合蛋白免疫保护性抗原、疫苗和应用，利 用原核表达体系构建了可以大量稳定表达a-actinin亚片段的表达菌株，同时纯化并获 得ACT-T蛋白，该蛋白作为抗原免疫感染阴道毛滴虫的小鼠后，小鼠在14天后基本痊愈，对 小鼠的免疫保护作用接近100%，将ACT-T融合蛋白作为抗原制成亚单位疫苗，从而实现对 小鼠的免疫保护，该疫苗具有广泛的开发应用价值。【附图说明】 图1为阴道毛滴虫a-actinin免疫保护性抗原诱导表达和纯化后的SDS-PAGE 图，其中：M为蛋白maker ;泳道1，2,3分别为全长序列后半段（ACT-T)表达菌株未经IPTG 诱导的菌液电泳，经过IPTG诱导的菌液电泳以及蛋白纯化后的电泳条带；泳道5,6,7分别 为全长序列前半段（ACT-F)表达菌株未经IPTG诱导的菌液电泳，经过IPTG诱导的菌液电 泳以及蛋白纯化后的电泳条带。 图2为将纯化的蛋白用兔抗阴道毛滴虫a-actinin多克隆抗体进western-blot 检测图；其中：Μ为蛋白maker ;泳道1为ACT-T蛋白；泳道2为ACT-F蛋白。 图3为阴道毛滴虫a -actinin免疫保护性抗原babl/c后的相对免疫保护分析 图。ACT-T (HC)和ACT-T (LC)分别代表ACT-T免疫的高浓度和低浓度组；ACT-F (HC)和ACT-F (LC)分别代表ACT-F免疫的高浓度和低浓度组；FA代表佐剂与PBS等体积混合后免 疫组；Control代表仅注射PBS的对照组。 图4为阴道毛滴虫a -actinin免疫保护性抗原最后一次免疫babl/c两周后的血 清中特异性抗体效价间接ELISA分析结果；其中，A图是分别以ACT-T和ACT-F纯化蛋白进 行包被后，血清按照1 :10000稀释后的总IgG 0D45Qnni数值；B图是分别以ACT-T和ACT-F纯 化蛋白进行包被后，免疫后的小鼠血清IgG抗体滴度；C图和D图是分别以ACT-F和ACT-T 纯化蛋白进行包被，检测血清抗体亚型〇D45(]nni数值(稀释度1 :1000)。【具体实施方式】 下面通过实施例，并结合说明书附图对本专利技术进一步具体描述。下述所使用的实 验方法若无特殊说明，均为本
现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说 明，均为通过商业途径可得到的配料或材料；本专利技术不应本文档来自技高网...
【技术保护点】
α‑actinin重组融合蛋白ACT‑T作为阴道毛滴虫病免疫保护性抗原的应用，其特征在于，其ACT‑T的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：伦照荣，谢祎婷，张佳，武亚平，王震杰，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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