本发明专利技术公开了一种猪链球菌2型10基因缺失株及应用，该菌株是在猪链球菌2型强毒力菌株SC的基础上敲除10个基因得到的，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015800。该菌株毒力较亲本菌株显著降低，安全性高，且免疫原性高，注射、滴鼻和口服途径免疫均能够保护免疫小鼠抵抗猪链球菌2型强毒力菌株的攻击，说明本疫苗可有效激活宿主的粘膜免疫系统和系统性免疫；同时，对不同ST型的猪链球菌2型强毒力菌株也具有交叉保护力。该疫苗制备方式简单，适合工业化生产。同时，由于该突变株的免疫原性与野生强毒株相似，因此可以作为标准品或全菌抗原应用到快速试剂盒的研制中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家畜传染病基因工程疫苗
，具体涉及一种猪链球菌2型10基因缺失株及应用。
技术介绍
猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，链球菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧，在血平板上可以产生α或β溶血，该菌能够生成荚膜，根据其荚膜抗原的不同，可以分为33个血清型(1-31,33,1/2型)。而根据7个管家基因(aroA,cpn60,dpr,gki,mutS,recA,thrA)序列的差异，可以将其分为不同的基因型(ST型)，目前，全世界已经发现了至少704种不同ST型的猪链球菌，众多的ST型要求猪链球菌疫苗具有交叉保护力。1954年，猪链球菌首次作为一种病原菌被报道，其天然宿主是猪，猪链球菌在猪群中的感染以血清2型为主，其次是血清9型和3型。猪感染猪链球菌会导致猪链球菌病，其症状有脑膜炎，败血症，关节炎，心内膜炎等，猪链球菌病给畜牧业的发展造成了严重的损失。与此同时，猪链球菌作为一种重要的人畜共患病原菌，不仅会造成猪的感染，也会导致人的发病，目前全世界报道的人感染猪链球菌的案例已经到达1600多例。在人的感染中，仍然以血清2型为主，其次是血清14型，而基因型则以ST1为主(图1)。猪链球菌感染人的案例已经覆盖加拿大、美国、阿根廷、法属圭亚那、法国、德国、意大利、荷兰、西班牙、英国、中国、柬埔寨、日本、泰国、越南等15个国家和地区，其中以亚洲最为严重。中国作为畜牧业大国，养猪产业发达，从事与猪养殖及相关产品加工的工作人员众多，因此，猪链球菌感染的后果也就更加严重。在1998年和2005年，我国的江苏省和四川省爆发了两次大规模的猪链球菌感染人的疫情，在这两次大爆发中，共有229人发病，52人死亡。同时，在这两次疫情中，感染者出现了罕见的中毒样休克综合征。除此之外，猪链球菌感染人的病例报道已经覆盖河南，湖北，江西，安徽，广东，广西，云南，香港，台湾等大部分中南部省份，形势十分严峻。与其他国家和地区不同的是，在中国，尽管猪链球菌的感染也是以血清2型为主，但是基因型却以ST7为主(图2)。猪链球菌感染范围之所以如此广泛，与它的感染方式不无关系。长久以来，猪链球菌作为一种能导致系统性感染病原菌，人们普遍认为其感染模式如下：环境中的猪链球菌会在一定条件下寄居在猪的扁桃体，这个过程并不一定导致发病，但是在一定条件下，扁桃体内的猪链球菌会进入血液，进而导致猪发病；而感染人则主要通过伤口直接进入血液(Gottsch alk and Segura,2000)。而近几年来，随着研究的深入，人们对于猪链球菌的感染途径提出了新的见解，认为猪链球菌不仅有图所示的经扁桃体进入血液，还可以通过粘膜尤其是胃肠道粘膜进入血液。其实早在2001年，有研究发现6份病人的直肠拭子为猪链球菌阳性，调查发现患者均曾摄取生猪肉，暗示了猪链球菌从胃肠道感染途径的存在(Goyette-Desjardins G,2014)；2004年荷兰科学家则发现猪链球菌可以在猪受到一定压力的条件下通过肠道进行感染(Bas Swildens,2004)，但此后关于猪链球菌通过肠道致病的研究进展缓慢，导致人们一定程度上忽略了猪链球菌的粘膜感染途径。近几年，日本一项研究表明，酒精可以促进猪链球菌通过肠道进行感染(T.Nakayama，2013)；荷兰的研究团队发现通过口服猪链球菌之后，猪出现临床症状，随后，该团队应用人结肠腺癌细胞Caco-2和猪小肠上皮细胞IPEC-J2，系统验证了不同血清型和基因型的猪链球菌对这两种细胞的粘附入侵和穿透能力，同时发现猪链球菌可以破坏这两种细胞的紧密连接，首次从细胞和分子水平揭示了猪链球菌对于人的肠道致病机制(Maria Laura Ferrando，2014)。2014年，牛津大学临床研究中心的一项评估报告指出，最易感染猪链球菌的人有两类，第一类是从事与生猪养殖，猪肉产品加工生产有关的职业人群，第二类是吃过被猪链球菌污染的食物的人群，两类人群的感染风险分别是38.1％和37.3％，(Vu Thi Lan Huong，2014)。同年，该研究中心发现，越南人喝猪血的习惯与猪链球菌感染存在很大相关性(Vu Thi Lan Huong，2014)。同时，也有研究在夏威夷和西班牙分别发现了由于食用了猪链球菌污染的食物而导致人感染的案例(Suwarat Wongjittraporn MD，2014；López-Mestanza C，2016)。2016年3月，Maria Laura Ferrando和Constance Schultsz提出了猪链球菌与宿主胃肠道互作的分子模型，并且正式提出猪链球菌应该被评估为一种食源性疾病(Maria Laura Ferrando，2016)。此外，目前多份临床数据显示猪群的扁桃体中猪链球菌阳性率达到100％，从病猪的肺部和扁桃体分离到猪链球菌。综上所述，猪链球菌可通过粘膜系统感染宿主或者通过某些机制暂时寄存于粘膜免疫组织(扁桃体)，因此有效激活粘膜免疫系统在预防猪链球菌感染和降低宿主的阳性携带率等方面发挥重要作用。目前已有的多份疫苗研究和专利成果均通过注射实现免疫，而通过注射途径进行免疫的方式在激活粘膜免疫系统具有一定的局限性，甚至不能有效激活粘膜免疫系统，因此亟需开发一种能有效激活粘膜免疫系统和系统免疫的疫苗。鉴于猪链球菌基因型的多样性和致病途径的复杂性，对于猪链球菌疫苗的研制就不能仅限于以往的注射疫苗，也需要同时开发能够激发多个部位免疫反应的口服疫苗，这种新型的猪链球菌口服疫苗应该不仅能够通过注射起作用，更能够通过口服起作用，并且具有一定的交叉保护力，能抵御不同ST型强毒力菌株的攻击。唯有如此，才能抵御猪链球菌通过血液 和粘膜系统等途径的感染。
技术实现思路
为了解决猪链球菌疫苗的需求，本专利技术构建了一株猪链球菌2型10基因缺失株，命名为LSM110D10，是在猪链球菌2型强毒力分离株SC的基础上，利用同源重组技术，依次敲除Sly、ScpA、SsnA、Fhb、SsadS、IgA1、Nudp、Ide Ssuis、endA、Mrp等10个基因而获得低毒力，高安全性、免疫原性好，高保护力，可以通过口服等多种途径免疫，且具备交叉保护力的菌株。该菌株已于2015年12月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌(Streptococcus suis)LSM110D10，保藏编号：CCTCC NO：M2015800，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术第二个目的是在于提供了一种猪链球菌2型10基因缺失株在制备治疗或预防猪链球菌2型感染药物中的应用，用该菌株制备的疫苗免疫小鼠后，注射、滴鼻和口服均具备显著的保护力，用以抵御同基因型的强毒力菌株SC19及异基因型的强毒力菌株LSM102(本专利技术或称ST658)的感染。本专利技术第三个目的在于为快速检测猪链球菌的提供标准品。目前已有的猪链球菌酶联免疫吸附试剂盒主要以灭活菌体或者荚膜多糖作为包被抗原，通过检测疑似感染动物的血清中猪链球菌抗体含量，来判断动物是否曾经感染猪链球菌。本专利技术的10基因缺失突变株不影响猪链球菌荚膜多糖的合成，保持了很高的免疫原性，可以作为标准品应用到快速检测试剂盒的生产中。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施：一种猪链球菌2型10基因缺失本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪链球菌2型10基因缺失株，其特征在于：猪链球菌（Streptococcus suis）LSM110D10，保藏编号为：CCTCC NO: M 2015800。
【技术特征摘要】
1.一种猪链球菌2型10基因缺失株，其特征在于：猪链球菌（Streptococcus suis）LSM110D10，保藏编号为：CCTCC NO: M 2015800。2....
【专利技术属性】
技术研发人员：李锦铨，周洋，王小红，李志伟，林蠡，董星星，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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