一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒。本发明专利技术建立的PRRSV血清学鉴别诊断试剂盒主要针对PRRSV类型有经典美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和高致病性PRRSV进行血清学鉴别诊断。第1个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型和美洲型共同抗原表位串联优化表达后的蛋白；第2个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型独特型抗原表位优化表达后的蛋白；第3个ELISA板的包被抗原是PRRSV美洲型独特型抗原表位优化表达后的蛋白；第4个ELISA板的包被抗原是高致病性PRRSV的Nsp2基因缺失区核苷酸序列表达的蛋白。经上述检测后，即可明确猪血清中PRRSV感染类型及抗体水平。本方法简便快捷，可有效用于不同类型PRRSV的临床血清学诊断。

Serological differentiation diagnostic kit for porcine reproductive and respiratory syndrome virus

The present invention provides a serological differential diagnosis kit for porcine reproductive and respiratory syndrome virus. The PRRSV serological identification Kit established by the invention mainly aims at the PRRSV type to have the classical American type PRRSV, the European type PRRSV and the highly pathogenic PRRSV to carry on the serological differential diagnosis. First ELISA plate coated antigen is PRRSV European and American type common epitope optimization of expression protein after second ELISA in the series; antigen is European type PRRSV unique epitopes of protein expression after optimization; third ELISA plate coated antigen is PRRSV America type idiotype antigen after optimizing the expression of epitope protein; fourth ELISA antigen is expressed in nucleotide deletion of Nsp2 gene sequences of highly pathogenic PRRSV protein. After the above test, the type of PRRSV infection and the level of antibody in pig serum can be determined. The method is simple and rapid and can be used effectively for clinical serological diagnosis of different types of PRRSV.

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒
本专利技术属于动物传染病学领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清学鉴别诊断试剂盒。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）属于网巢病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus），该类病毒为单股正链RNA病毒。PRRSV基因组长约15kb，分别为（5’端至3’端）：非结构蛋白ORF1（ORF1a和ORF1b）、结构蛋白ORF2a（GP2a）、ORF2b（GP2b）、ORF3（GP3）、ORF4（GP4）、ORF5（GP5）、ORF6（M）和ORF7（N）。PRRSV基因组结构和其他动脉炎病毒组基因组结构相似，在病毒的5’端有帽子结构，3’端多聚腺苷酸化。其非结构蛋白ORF1占基因组全长的75%左右，包含有PRRSV复制所需的酶类，参与病毒的增殖过程，可进一步细分为Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp9、Nsp1和Nsp11共10种非结构蛋白。结构蛋白中ORF2-ORF6编码病毒的囊膜蛋白，其中ORF2-ORF5编码的蛋白均为糖基化蛋白（GP2、GP3、GP4和GP5）而ORF6编码的M蛋白为非糖基化蛋白；ORF7编码病毒的核衣壳蛋白（N），有较强的免疫原性。猪繁殖与呼吸综合征是由PRRSV引起的，可导致妊娠母猪发热、厌食及繁殖障碍（如流产、早产、死胎、木乃伊胎），新生及断奶仔猪高死亡率的仔猪呼吸道疾病，俗称猪“蓝耳病”。根据PRRSV的血清学和基因组特征分析，PPRSV可细分为洲型（代表株为VR2332株）和欧洲型（代表株为LV株）。2006年，我国南方地区大部分猪场出现以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，即猪“高热病”，给我国养猪业造成极大损失。经国内各位猪病专家联合攻关，明确为该病病原为“高致病性蓝耳病”（即HP-PRRSV）。对HP-PRRSV基因组分析比较发现，HP-PRRSV在非结构蛋白2（Nsp2）存在连续核苷酸（约87个核苷酸，29个氨基酸）缺失。2008年，欧洲型PRRSV在我国福建和浙江猪群中首次发现报道，随后在我国多省市均检测到欧洲型PRRSV感染阳性。目前，我国猪群中PPRSV感染的类型较为复杂，为了更好的预防和控制PRRSV的流行，需要对猪群PRRSV血清学抗体进行科学有效区分。从病原学来看，根据欧洲型和美洲型PRRSV的基因组差异已见有RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法；此外，根据HP-PRRSV和美洲型PRRSV的基因组差异（主要是Nsp2）已见有RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法，但是上述实验方法（RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法）对实验操作者操作技能和实验仪器设备要求较高，不适宜临床现地使用。从血清学来看，已见有欧洲型和美洲型PRRSV鉴别诊断ELISA方法报道；此外，也见有HP-PRRSV和美洲型PRRSV的基因组差异鉴别诊断ELISA报道。但是，当前未见可同时区分欧洲型PRRSV、美洲型PRRSV和HP-PRRSV的血清学鉴别诊断试剂盒报道。抗原表位是指抗原分子表面具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能被其识别的免疫活性区。根据表位与受体细胞结合部位的差异，表位可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。本专利技术根据相关文献报道的不同类型PRRSV抗原表位特征和基因独特保守区为研究对象，建立检测不同类型PRRSV血清学鉴别诊断ELISA试剂盒：①美洲型和欧洲型PRRSV血清学抗体均可检测ELISA试剂盒；②仅检测欧洲型PRRSV血清学抗体的ELISA试剂盒；③仅检测美洲型PRRSV血清学抗体的ELISA试剂盒；④针对HP-PRRSV基因缺失区表达蛋白，该蛋白为包被抗原建立的ELISA方法，对前期检测为美洲型PRRSV感染阳性血清进行检测，检测结果为阴性值代表该血清为HP-PRRSV感染阳性。上述4种ELISA方法，经过组装形成的PRRSV血清学鉴别诊断试剂盒，可以供现地检测的试剂情况选择使用，有效用于对猪群中不同类型PRRSV感染情况进行鉴别诊断。本专利技术可填补P-RRSV血清学抗体鉴别诊断研究空白，为我国科学防控PRRSV提供新的检测手段和方法学参考。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒中包含4块ELISA板，且每块板的包被抗原核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-4所示。SEQIDNO.1：GGATCCCCGGAGAAGCCGCATTTCCCGCTGGCGACTGAAGATGACGTCCGTCATCACTTTACCCCGAGTACCCGTGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTGAGCGGCCGC；SEQIDNO.2：GGATCCTTCCGACCTCACGGGGTCTCAGCAGCGCAAGAGAAAATTTCCTTCGGAAAGTCGTCCCAATGAGCGGCCGC；SEQIDNO.3：GGATCCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTTGAGCGGCCGC；SEQIDNO.4：TCCCGACCGATGACGCCCTTGAGTGAGCCAATTTTTTTGTCTGCACCGCGACACAAATTTCAGCAGGTGGAAGAAGCGAATCCGGCG；本专利技术的优点在于：本专利技术提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒，具体基于不同类型PRRSV抗原表位建立的血清学鉴别诊断试剂盒。目前流行的PRRSV类型有经典美洲型PRRSV、高致病性PRRSV和欧洲型PRRSV，本专利技术建立的PRRSV血清学鉴别诊断试剂盒主要针对上述3种类型进行血清学鉴别诊断。第1个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型和美洲型共同抗原表位串联优化表达后的蛋白；第2个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型独特型抗原表位串联优化优化表达后的蛋白；第3个ELISA板的包被抗原是PRRSV美洲型独特型抗原表位串联优化优化表达后的蛋白；第4个ELISA板的包被抗原是高致病性PRRSV的Nsp2基因缺失区核苷酸序列表达的蛋白。经过上述4个ELISA平板检测后，即可明确猪血清中PRRSV感染类型及抗体水平。本方法简便快捷，可有效用于不同类型PRRSV的临床血清学诊断。与现有技术相比，本试剂盒可同时对PRRSV的不同血清学感染类型进行同时现地检测，方便、准确、快捷，可有效弥补病原学检测时所需的精密仪器和操作者操作能力的局限性，可以直接现地使用。附图说明图1表达蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白质分子量标准；1：空载体对照；2：目的蛋白。图2WesternBlot分析，M：蛋白质分子量标准；1：美洲型PRRSV；2：欧洲型PRRSV。图2-1欧洲型PRRSV的ORF4抗原表位分析。图2-2表达蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白质分子量标准；1：空载体对照；2：目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含4块ELISA板，且每块板的包被抗原核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈如敬，吴学敏，周伦江，陈秋勇，车勇良，严山，王晨燕，王隆柏，魏宏，刘玉涛，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35