本发明专利技术公开了一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5蛋白及其制备方法及应用，所述新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5蛋白为可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白，选用pCold TF DNA高效可溶性表达了PRRSV变异株GP5蛋白及TAT‑GP5融合蛋白，保证了重组蛋白的生物学功能，解决了现有的技术难以表达出完整的GP5蛋白的问题；豚鼠免疫接种试验表明，TAT‑GP5融合蛋白能够显著提高机体体液免疫和细胞免疫水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白，具体是一种新的 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白及其制备方法及应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征是PRRSV引起的以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症 状和高死亡率为特征的猪的一种病毒性传染病，该病给各国养猪业造成了巨大的经济损 失。自我国分离到该病毒以来，国内至少有22个省份发现该传染病，该传染病在有些省份 甚至流行过。随着PRRSV的遗传和变异，尤其是2006年后，HP-PRRSV变异株的出现，给养猪 业造成了巨大经济损失。免疫接种是目前防制PRRS的主要措施，但是PRRS灭活疫苗保护率 低，活疫苗不能免疫妊娠母猪和种猪，使猪群存在免疫空白，不利于该病的彻底防制。PRRSV 的高变异性也给疫苗免疫带来新的挑战。 GP5蛋白是PRRSV的重要结构蛋白之一，能起到参与体液免疫和细胞免疫的作用， 并具有较高的免疫原性和中和活性，是研宄PRRSV免疫保护的热点蛋白。但是，以GP5蛋 白为靶蛋白的亚单位疫苗免疫效果并不理想，可能原因是：（1)GP5蛋白是糖基化的囊膜蛋 白，含有高度保守的N-糖基化位点和高疏水区的信号肽序列，因而在大肠埃希菌等表达系 统中的表达一直不够理想，很难表达出完整的GP5蛋白，在以往的研宄中，多通过去除基因 N端的信号肽序列或跨膜区或通过密码子优化等手段以期获得GP5蛋白的表达，但多以包 涵体形式存在，可能影响GP5蛋白的生物学功能，尤其后期还需蛋白质复性才能获得可溶 性蛋白，而复性是十分复杂的过程，且复性效率往往与特定蛋白质的性质有关，选择何种方 法也需要反复试验，操作繁琐；（2)GP5蛋白抗原递呈作用比较弱。 pCold TF DNA为重组质粒载体，带有CspA(冷休克蛋白A)启动子及相关元件，使 得菌体在低温15°C环境下培养时，目的蛋白质的产量得到了提高，此外，pCold TF DNA自带 一段可溶性标签Trigger Factor (TF)，其作用是促使融合蛋白尽可能以可溶的形式存在， 有效提高目的蛋白质的可溶性。 TAT 是人免疫缺陷病毒 1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV_1)编 码的反式转录激活因子蛋白（trans-activator of transcription)的英文简称。TAT蛋 白中含有蛋白转导域（PTD)，是一段富含碱性氨基酸且带正电荷的多肽（含有11个核心 氨基酸YGRKKRRQRRR)，该区域与蛋白的转导功能有关，能够携带外源生物大分子物质如蛋 白质、多肽、核酸等通过细胞膜等生物活性膜，甚至可以通过血脑屏障。近年来，关于TAT 跨膜转导作用的应用及免疫促进等方面的研宄越来越多。2006年，Kittiworakarn J等 的实验研宄表明，HIV-TAT具有自佐剂（autoadjuvant)的能力，在没有佐剂存在的情况 下，合成的TAT101即能增强体液免疫反应，而这种罕见的功能受控于HIV-TAT蛋白核心 区域以及其形成半胱氨酸介导的寡聚物的能力（Kittiworakarn J，Lecoq A，Moine G，et al. HIV-ITat raises an adjuvant-free humoral immune response controlled by its core region and its ability to formcysteine-mediated oligomers. J Biol Chem， 2006,281(6) !3105-3115)。2010年，Kronenberg等在抗击利什曼原虫的研宄中，利用TAT 融合蛋白能有效刺激⑶8+T细胞介导的保护性免疫反应（Kronenberg K，Brosch S，Butsch F，et al. Vaccination with TAT-antigen fusion protein induces protective, CD8 (+) T cell-mediated immunity against Leishmania major. Journal of Investigative Dermatology，2010,130(11) :2602-2610)。Gadzinski 等于 2012 年发现 HIV-TAT 蛋白增强 体液免疫应答的这种能力可以转移到无关抗原DT92-106(白喉毒素多肽）及T24-36(黑 颈眼镜蛇α毒素多肽）上，即增强这两种合成抗原引起的免疫反应，而相比之下完整的 ΤΑΤ1-57多肽片段比部分片段ΤΑΤ37-57的免疫效果好（Gadzinski A，Matz D，Favre E，et al. Transfer of the ability of HIV-I Tat to raise an adjuvant-free humoral immune response to unrelated antigens · Vaccine，2012, 30 (18) :2859-2868)。同时，Wu 等通 过实验发现了 HIV-TAT的另一功能，该研宄采用融合表达的方法，利用TAT的核心肽段可以 提高外源蛋白EGFP在大肠杆菌中的高效可溶性表达（Wu Y，Ren C，Gao Y et al. A novel method for promot ing heterologous protein expression in Escherichia coli by fusion with the HIV-I TAT core domain. Amino Acids,2010,39 ：811-820)〇 因此，本专利技术选用pCold TF DNA高效可溶性表达了 PRRSV变异株GP5蛋白及 TAT-GP5融合蛋白，豚鼠免疫接种试验表明，TAT-GP5融合蛋白能够显著提高机体体液免疫 和细胞免疫水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的可溶性表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株 GP5重组蛋白及其制备方法及应用，融合TAT后，提高了重组蛋白的免疫原性。 为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案： 一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白，为可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白，所述可溶性表达PRRSV GP5完 整蛋白的核苷酸序列为：GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTC TTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGA TTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTT GTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCT GGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCAC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白，其特征在于，为可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白，所述可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白的核苷酸序列为：ACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAA如SEQ ID NO：1所示，其中，斜体部分为引物区域；所述可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白的核苷酸序列为：ACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAA如SEQ ID NO：2所示，其中，斜体部分为引物区域，粗体部分为TAT序列。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄娟，单虎，任颖超，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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