一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸及其制备方法，涉及血清学检测技术领域，包括底板，底板的顶部设置有检测层，检测层上设置有检测线和对照线，检测层的顶部靠近对照线的一侧设置有吸收层，靠近检测线的一侧设置有免疫金标垫，免疫金标垫的顶部设置有样品垫；免疫金标垫上涂覆有胶体金颗粒，该胶体金颗粒上结合有SPA标记物，检测线上涂覆/浸润有A型口蹄疫病毒样颗粒，对照线上涂覆/浸润有兔IgG。本发明专利技术能够缩短检测周期，实现现场进行实时快速的测定。

Colloidal gold test paper for testing animal type A foot and mouth disease and preparation method thereof

The invention discloses a method for colloidal gold strip and preparation method of test animal type A foot-and-mouth disease, which belongs to the technical field of serological detection, which comprises a bottom plate, the bottom plate is arranged on the top layer detection, detection layer is arranged on the test line and control line, the top layer close to the side of the detection line is arranged on the absorption layer one side, close to the detection line is arranged at the top of immunogold pad, immunogold pad is provided with a sample pad; immunogold pad is coated with colloidal gold particles, the colloidal gold particles are combined with SPA marker detection line coated / invasion type A foot-and-mouth disease virus like particles, coating / control line the invasion of rabbit IgG. The invention can shorten the detection period and realize real-time and rapid measurement on the spot.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及血清学检测
，具体涉及一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸及其制备方法。
技术介绍
FMD(footandmouthdisease，口蹄疫)是由FMDV(footandmouthdiseasevirus，口蹄疫病毒)感染偶蹄类动物后引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，家畜中的牛、猪、山羊、绵羊等均为易感动物，口蹄疫一旦爆发往往造成大流行，不易控制和消灭，给疾病流行国家和地区的畜牧业带来严重的经济损失。因此，世界动物卫生组织(OIE)将该病列在15个A类动物疫病之首，我国政府也将口蹄疫排在14个一类动物传染病的第一位。口蹄疫病毒病毒的基因组RNA全长约8.5kb，依次为5’UTR、ORF和3’UTR组成，起重ORF约6.5kb长，由L基因、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及其始密码子和终止密码子组成。口蹄疫病毒病毒的外壳为对称的20面体，由衣壳蛋白VP1，VP2，VP3和VP4组成，这些衣壳蛋白决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力。目前已知的口蹄疫病毒病毒有7个血清型：O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型和Asia1型，同时，还包括65个以上的亚型。其中，A型口蹄疫病毒流行较为广泛，是仅次于O型口蹄疫的主要流行毒株。近年来，口蹄疫疫情频繁发生且呈全球化流行的态势，且A型口蹄疫多在我国周边国家发生和流行，这不仅对世界畜产品经济构成了巨大的威胁，而且引发了人们对食品安全等社会公共卫生问题的担忧，造成发生疫情的国家及地区的畜产品贸易损失惨重。目前口蹄疫抗体的检测方法主要包括CFT(补体结合试验)、VNT(人玻连蛋白)、凝集试验、免疫扩散和ELISA(酶联免疫吸附测定法)等，但是这些方法容易受到外部环境的干扰，需要在条件稳定的实验室中进行检测，检测周期长，无法在现场进行实时快速的测定。许多病毒的结构蛋白在不同的培养系统中具有组装成重复序列或者病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)的能力，这种VLPs不携带遗传物质，因此不具有感染性，VLPs能够重复并且高密度的展示抗原位点，能引起强烈的免疫反应。同时，一些病毒的VLPs与病毒的亚病毒粒子(subviralparticles，SVPs)相似，能够VLPs直接作为疫苗使用，除此之外，VLPs还能作为载体，插入外源的抗原位点形成嵌合型的VLPs，基于VLPs的上诉特征，口蹄疫病毒的VLPs成为目前口蹄疫检测研究的热点之一。大肠杆菌表达系统具有易于培养，设备简单且安全性高的优点，成为目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一，被广泛应用于生物制药行业中，但是，在大肠杆菌中采用单独表达口蹄疫病毒外壳蛋白、或用不同质粒共转染大肠杆菌获得的基因工程菌的方法所表达的口蹄疫病毒外壳蛋白，不仅表达量非常低，而且常常不可溶，不能用于大规模商业应用，因此，采用传统的大肠杆菌表达系统制备A型口蹄疫病毒的VLPs以用于检测难以实现。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸及其制备方法，能够缩短检测周期，实现现场进行实时快速的测定。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，包括底板，底板的顶部设置有检测层，检测层包括检测线和对照线，检测层的顶部靠近对照线的一侧设置有吸收层，靠近检测线的一侧设置有免疫金标垫，免疫金标垫的顶部设置有样品垫；免疫金标垫上涂覆有胶体金颗粒，该胶体金颗粒上结合有SPA标记物，检测线上涂覆/浸润有A型口蹄疫病毒样颗粒，对照线上涂覆/浸润有兔IgG。在上述技术方案的基础上，所述免疫金标垫上胶体金与SPA的比例为2×104:1～2。在上述技术方案的基础上，所述免疫金标垫上胶体金与SPA的比例为2×104:1.3。在上述技术方案的基础上，所述免疫金标垫的吸附比例为10～50μL/cm。在上述技术方案的基础上，所述检测线上涂覆/浸润有浓度为0.5～1mg/mL的A型口蹄疫病毒样颗粒。在上述技术方案的基础上，所述对照线上涂覆/浸润有浓度为0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG。一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：A、制备LgG，制备并纯化胶体金，将胶体金与SPA按质量比为2×104:1～1.5反应，得到免疫胶体金，将浓度为1～1.2g/ml的免疫胶体金按吸附比为10～50μL/cm吸附在玻璃膜上，得到免疫金标垫；B、使用硝酸纤维膜作为检测层基材，在检测线上喷涂浓度为0.5～1mg/mL的A型口蹄疫病毒样颗粒，在对照线上喷涂浓度为0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG；在检测层的中部距检测线0.3～1cm处，喷涂对照线，喷膜量为5～15μl/1cm进行喷膜，喷膜后干燥得到检测层；C、在底板1的顶部设置检测层，并将检测层；压平，将吸收层一部分固定在底板上，一部分固定在检测层；上靠近对照线的部分，将免疫金标垫的一侧固定在底板上，另一侧固定在检测层；靠近检测线的一侧，样品垫的一侧固定在底板上，样品垫的一侧固定在底板上，另一侧固定在免疫金标垫上。在上述技术方案的基础上，免疫金标垫的制备方法为：使用浓度为0.1M的K2CO3调整胶体金的pH值为5.9，按质量比为2×104::1～1.5将相应的SPA溶液加入胶体金中放置30min后，在转速为10000r/min、温度为4℃的条件下离心30min，将沉淀溶于重悬液中混合均匀，用玻璃膜吸附后晾干。在上述技术方案的基础上，所述检测线上A型口蹄疫病毒样颗粒的浓度为0.8mg/mL，所述对这线上免疫兔血清IgG的浓度为1mg/mL。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术的一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，由于检测层上设置有检测线和对比线，且检测线上涂覆/浸润有浓度为0.5～1mg/mLA型口蹄疫病毒样颗粒，对照线上涂覆/浸润有浓度为0.8～1.5mg/mL兔IgG，在使用时，直接将血液样品稀释后在现场(温度在0～35°均可)进行检测，如果血液样品中含有A型口蹄疫抗体，血液样品中的抗体与免疫金标垫中SPA修饰的胶体金结合形成复合物，与检测线上A型口蹄疫病毒样颗粒结合形成紫红色线条，继续前行，未与抗原结合的抗体携带重组蛋白SPA与对照线中的IgG抗体形成紫红色线条。将检测结果与常规的CFT、VNT凝集试验、免疫扩散和ELISA进行比较，结果基本一致，且本专利技术的血液未经过纯化，说明本专利技术的准确度较高，且检测条件不高，稳定性较好，具有操作简单、检测快速、结果清楚，易于判断和保存，且无需大型仪器设备，成本较低，能够用于临床快速实时检测，快速检测流行病，便于快速采取相应措施，避免疾病大规模爆发。附图说明图1为本专利技术实施例中用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸的结构示意图。图2为本专利技术实施例中体外组装的病毒样颗粒电镜图。图中：1-底板，2-样品垫，3-免疫金标垫，4-检测层，5-吸收层，6-检测线，7-对照线。具体实施方式以下结合附图及实施例对本专利技术作进一步详细说明。参见图1所示，本专利技术实施例提供一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，包括采用PVC制成的底板1，底板1的顶部设置有检测层4，检测层4包括检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，其特征在于：包括底板(1)，底板(1)的顶部设置有检测层(4)，检测层(4)上设置有检测线(6)和对照线(7)，检测层(4)的顶部靠近对照线(7)的一侧设置有吸收层(5)，靠近检测线(6)的一侧设置有免疫金标垫(3)，免疫金标垫(3)的顶部设置有样品垫(2)；免疫金标垫(3)上涂覆有胶体金颗粒，该胶体金颗粒上结合有SPA标记物，检测线(6)上涂覆/浸润有A型口蹄疫病毒样颗粒，对照线(7)上涂覆/浸润有兔IgG。

【技术特征摘要】
1.一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，其特征在于：包括底板(1)，底板(1)的顶部设置有检测层(4)，检测层(4)上设置有检测线(6)和对照线(7)，检测层(4)的顶部靠近对照线(7)的一侧设置有吸收层(5)，靠近检测线(6)的一侧设置有免疫金标垫(3)，免疫金标垫(3)的顶部设置有样品垫(2)；免疫金标垫(3)上涂覆有胶体金颗粒，该胶体金颗粒上结合有SPA标记物，检测线(6)上涂覆/浸润有A型口蹄疫病毒样颗粒，对照线(7)上涂覆/浸润有兔IgG。2.如权利要求1所述的一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，其特征在于：所述免疫金标垫(3)上胶体金与SPA的比例为2×104:1～2。3.如权利要求2所述的一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，其特征在于：所述免疫金标垫(3)上胶体金与SPA的比例为2×104:1.3。4.如权利要求1所述的一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，其特征在于：所述免疫金标垫(3)的吸附比例为10～50μL/cm。5.如权利要求1所述的一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，其特征在于：所述检测线(6)上涂覆/浸润有浓度为0.5～1mg/mL的A型口蹄疫病毒样颗粒。6.如权利要求1所述的一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸，其特征在于：所述对照线(7)上涂覆/浸润有浓度为0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG。7.一种用于测试动物A型口蹄疫的胶体金试纸的制备方法，其特征在于、包括以下步骤：A、制备LgG，制备并纯化胶体金，将胶体金与SPA按质量比为2×104:1～1.5反应，得到免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，郭慧琛，张韵，常艳燕，魏衍全，茹嘉喜，智晓莹，杜平，刘湘涛，殷宏，罗建勋，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62