一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条制造技术

本发明专利技术公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条。该试纸条包括：样品吸收垫、含有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜、有检测线T和对照线C的硝酸纤维素膜、吸水滤纸和底板；检测线T包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体，对照线C包被有二抗IgG；样品吸收垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互搭接粘贴于底板上。本发明专利技术利用膜层析双抗体夹心法检测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒，其操作简单、方便、快捷，不需要特殊仪器设备和专业培训，易于推广，结果清晰易辨，适合基层，适合突发事件的大批量现场检测和流行病学调查，对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染诊断起到辅助作用。

Test paper for rapid detection of colloidal gold of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

The invention discloses a colloidal gold rapid detection test paper strip for porcine reproductive and respiratory syndrome virus. The test strip includes: porcine reproductive and respiratory absorption pad, containing colloidal gold labeled synthetic glass fiber membrane, protein M syndrome virus monoclonal antibody detection line T and nitrocellulose membrane, the control line C absorbent filter and the bottom plate; detection line T coated with porcine reproductive and respiratory syndrome virus protein synthesis GP5 monoclonal antibody, C control line is coated with two anti IgG; sample absorption pad, glass fiber membrane, nitrocellulose membrane and absorbent filter are pasted on the bottom plate overlap. The invention uses membrane chromatography samples double antibody sandwich method in porcine reproductive and respiratory syndrome virus, its operation is simple and convenient, do not need special equipment and professional training, easy popularization, the clear, suitable for mass detection and epidemiological investigation, the scene for emergencies, to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection diagnosis play a supporting role.

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条
本专利技术属于动物病毒性疾病监测和诊断试剂领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍、仔猪出现呼吸道疾病为特征的传染病。是世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）列入的93种法定报告的动物疫病之一。据统计，该病每年给美国的养猪业造成近5.6亿美元的经济损失（ChoandDee,2006）。我国于1996年从流产胎儿中分离到PRRSV，证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征。随着病毒的遗传和变异，2006年，我国又爆发了以变异美洲型病毒为病原的高致病性猪蓝耳病（TianKetal.,2007），使我国养猪业蒙受了巨大的经济损失。目前检测PPRSV的方法主要有RT-PCR法、病毒分离鉴定、免疫组化法、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法，但这些方法要么需要操作活病毒，要么操作复杂、耗时长，要么特异性和敏感性不足，不利于基层的应用和推广。病毒检测方法：1、血清学试验血清学方法是目前广泛应用于实验室的检测方法。目前国内外已经建立了4种检测PRRS抗体的方法。1）免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）IPMA是广泛应用于该病诊断的一种方法，敏感性和特异性都比较好，可用于PRRSV抗原的检测，病毒鉴定及血清抗体检测。目前该方法在欧美等国家已经广泛应用于PRRSV感染的研究中。试验主要在Marc-145培养物上进行。IPMA能在感染后6天血清中检测到PRRSV抗体，具有较高的特异性。2）间接荧光抗体试验（IFA)免疫荧光抗体染色技术是应用异硫氰酸荧光素标记，建立了免疫荧光抗体技术用于直接检测仔猪肺组织中的抗原。有的直接采集小猪的肺泡巨噬细胞进行直接培养，用病毒特异性荧光抗体进行检测。3）血清中和试验（SN）SN检测PRRSV抗体虽然特异性良好，但PRRSV的SN抗体比IFA抗体在血清中出现的晚，对急性感染的敏感性差，因此SN不适合做早期诊断，而且细胞培养工作量大、技术性强，目前仅适于实验室研究用。作为经典方法在病毒鉴定中起着重要的作用，许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。4）间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA)ELISA灵敏度高，特异性好，制好的诊断膜片常温下保存时间长，携带寄送方便，操作简便，快速，不需要特殊实验条件，反应板可重复使用多次，结果客观，肉眼易于判断。2、分子生物学诊断技术利用RT-PCR、核酸探针、序列测定和原味杂交等方法对PRRSV进行分子诊断和分型，从分子水平揭示抗原变异的基础和毒种演化过程。RT-PCR扩增病毒基因组的通用引物分别针对欧美毒株的特异性引物进行分型鉴定。嵌套性RT-PCR中同时使用通用引物和特异性引物在一次PCR反应中即可进行分型诊断。胶体金免疫层析法（ImmunochromatographyAssay）始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印记技术、免疫标记技术和层析技术的结合。将包被抗原、将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试纸条，使用时只需要将试纸条插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于试纸条形式，无需低温保存，储运方便。针对猪蓝耳病的流行现状和防治要求，对于猪蓝耳病的诊断，不但要求高的特异性和敏感性，还需要快速、简便、易于基层医疗和卫生单位使用。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条，该试纸条使用方便、快捷，可检测猪标本中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的辅助诊断。本专利技术的另一目的在于提供上述猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条，包含：样品吸收垫（玻璃纤维膜）、含有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜、依次有检测线T和对照线C两条带的硝酸纤维素膜、吸水滤纸和底板；所述的检测线T包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体，对照线C包被有二抗IgG；样品吸收垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互搭接粘贴于底板上。所述的二抗IgG优选为抗鼠IgG抗体。所述的玻璃纤维膜中胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体的标记pH优选为7.4-7.8，胶体金和M蛋白单克隆抗体的配比优选为15-20μg/mL胶体金。所述的硝酸纤维素膜中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体包被浓度优选为1.0mg/mL，包被量1-5μL/cm；二抗IgG包被浓度优选为1.5mg/mL，包被量1-5μL/cm。上述猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：将胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上；将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜检测线T处，将二抗IgG包被于硝酸纤维素膜对照线C处；在底板上依次相互搭接粘贴样品吸收垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸。优选的，上述猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：（1）制备猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体。（2）硝酸纤维膜的制备：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的单克隆抗体稀释成1.0mg/mL，将二抗IgG稀释成1.5mg/mL，均以1-5μL/cm的量喷于硝酸纤维膜上，形成检测线T和对照线C，干燥后备用。（3）玻璃纤维膜的制备：将胶体金的pH调整为7.4-7.8，胶体金和猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体的配比为15-20μg/mL胶体金，经稳定剂处理后，喷涂于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用。（4）在底板上依次相互搭接粘贴样品吸收垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸。本专利技术所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条可用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。其使用方法包括如下步骤：将待检样品滴在样品吸收垫处，5-10min判定结果，对比检测线T和对照线C的颜色，检测线T和对照线C同时出现红色，为阳性反应（说明待检样品中含有猪繁殖与呼吸综合征病毒）；对照线C出现红色，检测线无颜色变化，为阴性反应（说明血清中无猪繁殖与呼吸综合征病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒量不足）；对照线无颜色变化，则说明试纸条失效。本专利技术采用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法原理检测标本中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原。应用本专利技术试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需要特殊本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于包含：样品吸收垫、含有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜、依次有检测线T和对照线C两条带的硝酸纤维素膜、吸水滤纸和底板；所述的检测线T包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体，对照线C包被有二抗IgG；样品吸收垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互搭接粘贴于底板上；制备所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体与猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的M蛋白与GP5蛋白通过包括如下步骤的方法制备得到：(1)用如下引物分别扩增M蛋白基因片段和GP5蛋白基因片段：M蛋白基因上游引物：5’‑GTAGGTACCACCATGGGGTCGTCCTTAGATGACTTC‑3’，M蛋白基因下游引物：5’‑GACCTCGAGCCGTTGTTATTTGGCATATT‑3’；GP5蛋白基因上游引物：5’‑CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC‑3’，GP5蛋白基因下游引物：5’‑GGTACCCTAGAGACCCCATCGTTC‑3’；(2)PCR扩增产物电泳后分别切胶回收，分别与pMD‑18T克隆载体16℃过夜连接，转化DH5α感受态细胞中，挑取单克隆37℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆，送测序；(3)用限制性内切酶BamHI、XhoI酶切分别连接有M基因和GP5基因的pMD‑18T载体和PET‑32a(+)，1％琼脂糖电泳切胶回收M基因和GP5基因目的片段和PET‑32a(+)双酶切后的大片段，用T4DNA连接酶分别将二者连接过夜，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养8～10小时，分别挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组质粒送出测序；(4)将重组质粒转入BL21中，并进行诱导表达得到M蛋白和GP5蛋白；(5)使用含有HIS标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白。...

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于包含：样品吸收垫、含有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜、依次有检测线T和对照线C两条带的硝酸纤维素膜、吸水滤纸和底板；所述的检测线T包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体，对照线C包被有二抗IgG；样品吸收垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互搭接粘贴于底板上；制备所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体与猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的M蛋白与GP5蛋白通过包括如下步骤的方法制备得到：(1)用如下引物分别扩增M蛋白基因片段和GP5蛋白基因片段：M蛋白基因上游引物：5’-GTAGGTACCACCATGGGGTCGTCCTTAGATGACTTC-3’，M蛋白基因下游引物：5’-GACCTCGAGCCGTTGTTATTTGGCATATT-3’；GP5蛋白基因上游引物：5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’，GP5蛋白基因下游引物：5’-GGTACCCTAGAGACCCCATCGTTC-3’；(2)PCR扩增产物电泳后分别切胶回收，分别与pMD-18T克隆载体16℃过夜连接，转化DH5α感受态细胞中，挑取单克隆37℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆，送测序；(3)用限制性内切酶BamHI、XhoI酶切分别连接有M基因和GP5基因的pMD-18T载体和PET-32a(+)，1％琼脂糖电泳切胶回收M基因和GP5基因目的片段和PET-32a(+)双酶切后的大片段，用T4DNA连接酶分别将二者连接过夜，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养8～10小时，分别挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组质粒送出测序；(4)将重组质粒转入BL21中，并进行诱导表达得到M蛋白和GP5蛋白；(5)使...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建，漆世华，谢红玲，温文生，韩兴，舒银辉，廖园园，刘洁，秦红刚，徐松，牟林琳，朱薇，冯钊，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42