一种能同时检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条及制备方法技术

本发明专利技术涉及动物医学领域，公开了一种检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条及制备方法。该试纸条包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述金标垫包被了带有抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的胶体金标记蛋白；所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线；所述硝酸纤维素膜的检测线包被抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ，所述硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗鼠IgG抗体。本发明专利技术可同时检测鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒，极大程度降低了反应的假阳性，提高了检测的特异性以及灵敏度。

Colloidal gold test paper strip capable of simultaneously detecting waterfowl source parvovirus and preparation method thereof

The invention relates to the field of animal medicine, and discloses a colloidal gold test paper strip for detecting the parvovirus of waterfowl and a preparation method thereof. The test strip comprises a bottom plate, a sample pad, gold labeled pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad; the gold labeled pad is coated with colloidal gold monoclonal antibodies against gosling plague virus of the labeled protein; the nitrocellulose membrane samples respectively along the flow direction with the detection line and control line detection; the nitrocellulose membrane coated monoclonal antibody against gosling plague virus II, the control line of the nitrocellulose membrane coated with Goat anti mouse IgG antibody. The invention can simultaneously detect goose parvovirus, Duck Parvovirus and model of Muscovy Duck Parvovirus, greatly reduced the false positive reaction, improve the detection sensitivity and specificity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物医学领域，具体为一种能同时检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条及制备方法。
技术介绍
水禽源细小病毒，指感染水禽(这里主要指家养的各品种鸭和鹅，野生水禽中大雁、天鹅等)并致水禽发病的细小病毒，包括鹅细小病毒、番鸭细小病毒、新型番鸭细小病毒等。水禽细小病毒的检测方法有病毒的分离鉴定、分子生物学检测和血清学检测等。病毒分离鉴定方法是将病料在特定的细胞中培养，几次传代后根据是否出现特定的病变，再根据电镜形态的观察来判断，耗时长，需要的设备多，对人员的技术水平要求高。分子生物学检测中的PCR技术、环介导等温扩增技术和核酸探针技术能特异性检测病料组织中的病毒，准确度高，但技术要求高，需要特殊的设备，操作繁琐，检测成本高，不适宜临床上的推广。血清学检测包括ELISA、琼脂免疫扩散法、反向间接血凝试验、病毒中和试验、免疫荧光抗体技术、胶体金免疫层析技术等。ELISA方法有斑点ELISA、间接ELISA和双抗体夹心ELISA，后两种方法需要先对病毒进行分离，耗时长，只有斑点ELISA能直接检测病料，在4h内完成，其检测限为4.833ng/mg。琼脂免疫扩散法操作简便，需时1天，适于基层推广和应用，但灵敏度不高。反向间接血凝试验可以在3h内可以检测出病料及粪样中的病毒，其检测限为24ng/mL，有很好的实用价值，但易受到非特异性因素的影响。病毒中和试验重复性好，敏感性高，但检测时间长达数天，不适于大量病料组织的快速检测。免疫荧光抗体技术重复性好、具有较强的特异性和敏感性，操作简便、2小时内完成，但需要特殊的仪器，不适合基层推广。现有技术中胶体金试纸条只能检测一种水禽源细小病毒，使用范围窄，限制了其在实际中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能同时检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条及制备方法。本专利技术具体的技术方案如下：一种检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条，它包括底板、样品垫、吸水垫、金标垫、硝酸纤维素膜；所述底板的一端粘附有所述样品垫，其另一端粘附有所述吸水垫，其中部依次粘附有所述金标垫、所述硝酸纤维素膜；所述金标垫的一端与所述样品垫相粘附，其另一端与所述硝酸纤维素膜相粘附，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫相粘附；所述金标垫包被了带有抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的胶体金标记蛋白；所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线；所述硝酸纤维素膜的检测线包被抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ，所述硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗鼠IgG抗体。优选的，所述胶体金标记的抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的包被浓度为20～90μg/mL。优选的，所述硝酸纤维素膜上抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ的包被浓度为1～3mg/mL。优选的，所述硝酸纤维素膜上羊抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.2～2mg/mL。本专利技术还包括上述的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：抗体的制备：以浓缩并纯化的小鹅瘟病毒为抗原免疫小鼠制备抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ和抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ，并进行纯化；具体为，以浓缩并纯化的小鹅瘟病毒为抗原免疫小鼠，与弗氏完全佐剂乳化，皮下多点注射小鼠，每隔2周以相同的抗原加弗氏不完全佐剂加强免疫。最后一次免疫后1周采血制备血清，以间接ELISA方法测定效价，将血清效价达到1:1000及以上的小鼠进行1次无佐剂抗原加强免疫，3天后取脾脏，进行细胞融合、筛选、克隆化及腹水制备。得到了同属于IgG类IgG1亚类的两株高效价单克隆抗体：抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ和抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ。制备抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的胶体金标记蛋白溶液：首先按柠檬酸还原法制备胶体金溶液，用0.1mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH至7.0～8.0，按20～90μg/mL的比例将抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ与胶体金溶液搅拌混合，再加入30～80g/L的BSA溶液，使其终质量浓度为5～20g/L，以2000～5000r/min的速度离心取上清，再以10000～14000r/min离心得沉淀物，沉淀用含5～15g/L的BSA和5～15g/L的蔗糖的0.001～0.1mol/L的Tris-HCl溶液重悬至原体积的1/10～1/5，得到抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的胶体金标记蛋白溶液；本专利技术纯化的抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ与胶体金偶联的pH值为7.0～8.0，优选为7.2～7.8，具体优选为7.4；最佳结合量为20～90μg/mL，优选为30～70μg/mL，进一步为50μg/mL。将金标垫浸渍于胶体金标记的单克隆抗体3D9。金标垫的制备：将玻璃纤维素膜浸泡于抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的胶体金标记蛋白溶液中，经浸透、室温干燥后，制得金标垫；硝酸纤维素膜的制备：将1～3mg/mL的抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ喷涂于硝酸纤维素膜上的检测线，优选包被浓度为2mg/mL；将0.2～2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体喷涂于硝酸纤维素膜上的质控线，优选包被浓度为1mg/mL；室温干燥，浸泡于10～30g/L的BSA溶液中，室温静置后，PBST洗涤，室温干燥，即为硝酸纤维素膜；组装：将样品垫和制备好的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫依次粘贴于底板上，得到胶体金试纸条。对制备好的试纸条进行特异性、灵敏度、检测范围的验证。结果表明，本专利技术的胶体金试纸条对鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和新型番鸭细小病毒(NMDPV)的检测结果为阳性，证明本专利技术的胶体金试纸条对GPV、MDPV和NMDPV有较好的特异性。本专利技术的胶体金试纸条是将抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ作为捕获抗体，将抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ作为检测抗体，极大程度降低了反应的假阳性，提高了检测的特异性以及灵敏度。通过一系列稀释梯度的GPV-C3株、MDPV-ZJ株、NMDPV-FJ1341株的鸭胚适应毒进行灵敏度检测，得到本专利技术胶体金试纸条对GPV、MDPV和NMDPV的最低检出量分别为104.7ELD50/mL、104.7ELD50/mL和105.7ELD50/mL。本专利技术的胶体金试纸条能同时检测鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒，灵敏度高，重复性好，临床检验没有假阳性。附图说明下面结合附图对本专利技术做进一步说明。图1：不同病毒的胶体金试纸条检测结果，从左至右依次为：鹅细小病毒、番鸭细小病毒、新型番鸭细小病毒、猪细小病毒、I型鸭甲肝病毒、坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9N2亚型禽流感病毒、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒；图2：GPV-C3株的检测敏感性结果，从左至右的稀释倍数依次为：1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024；图3：本专利技术胶体金试纸条的示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备1.1小鼠免疫以浓缩并纯化的小鹅瘟病毒为抗原，与弗氏完全佐剂乳化，皮下多点注射小鼠，每隔2周以相同的抗原加弗氏不完全佐剂加强免疫5次。最后一次免疫后1周采血制备血清，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条，其特征在于，它包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述底板的一端粘附有所述样品垫，其另一端粘附有所述吸水垫，其中部依次粘附有所述金标垫、所述硝酸纤维素膜；所述金标垫的一端与所述样品垫相粘附，其另一端与所述硝酸纤维素膜相粘附，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫相粘附；所述金标垫包被了带有抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的胶体金标记蛋白；所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线；所述硝酸纤维素膜的检测线包被抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ，所述硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗鼠IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条，其特征在于，它包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述底板的一端粘附有所述样品垫，其另一端粘附有所述吸水垫，其中部依次粘附有所述金标垫、所述硝酸纤维素膜；所述金标垫的一端与所述样品垫相粘附，其另一端与所述硝酸纤维素膜相粘附，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫相粘附；所述金标垫包被了带有抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的胶体金标记蛋白；所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线；所述硝酸纤维素膜的检测线包被抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ，所述硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗鼠IgG抗体。2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ的包被浓度为20～90μg/mL。3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ的包被浓度为1～3mg/mL。4.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上羊抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.2～2mg/mL。5.如权利要求1-4任意一项所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：抗体的制备：以浓缩并纯化的小鹅瘟病毒为抗原免疫小鼠制备抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅰ和抗小鹅瘟病毒单克隆抗体Ⅱ，...

【专利技术属性】
技术研发人员：程龙飞，张长弓，黄瑜，何琼，贾志娟，陈慧敏，傅秋玲，傅光华，施少华，万春和，刘荣昌，陈红梅，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，厦门市波生生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35