【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种快速检测猪捷申病毒的荧光rt-raa引物探针组、试剂盒及方法。
技术介绍
1、猪捷申病毒(porcineteschovirus,ptv)属于微rna病毒科捷申病毒属，基因组长度约7.1kb，包含1个开放阅读框(orf)，编码的多聚蛋白经蛋白酶切割形成p1、p2、p3多肽前体，分别编码结构蛋白vp1、vp2、vp3、vp4，和非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c。该病已在捷克、西班牙、意大利、巴西等地区报道，具有高阳性率和广泛性的特点。国内ptv流行病学调查发现上海市、江苏省、湖南省的阳性率分别为85.7％，47.5％和14.88％，说明该病具有一定的区域流行性。
2、在临床上，该病常与猪流行性腹泻、猪轮状病毒等肠道病毒混合感染，或者呈潜伏感染状态而容易被忽视，但是感染该病会引起猪群的脑脊髓灰质炎、心包炎、心肌炎、肺炎、腹泻和繁殖障碍等症状，对生猪健康养殖造成不利影响，因此需要建立一种快速、灵敏、特异的检测方法。
3、目前，猪捷申病毒的检测方法主要是通过病毒分离、免疫荧光、普通pcr等检测技术，但是传统方法有操作复杂、耗时长、仪器要求高等缺点，在临床快检应用上具有一定的局限性。raa是一种新型的核酸检测方法，具有扩增耗时短、操作简单且支持多样化数据读取等优势，不需要特殊仪器和专业实验室，支持现场恒温快检，更易应用于临床，推广性强。因此，通过荧光rt-raa技术建立快速检测方法，旨在为现场猪捷申病毒检测提供快速、简便的技术手段。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种快速检测猪捷申病毒的荧光rt-raa引物探针组、试剂盒及方法。本专利技术基于猪捷申病毒5'utr基因序列设计荧光rt-raa引物和探针，利用该引物和探针建立的rt-raa检测方法，具有特异性好、敏感度高、可重复性好等特点。同时该方法检测时间只需要21分钟，可恒温扩增，适合临床现场快速检测，尤其在野外无特定实验条件的情况下具有独特的优势和使用价值。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种用于检测猪捷申病毒的荧光rt-raa引物探针组，其包括用于检测猪捷申病毒的上游引物ptv-f、下游引物ptv-r和荧光探针ptv-p，所述上游引物ptv-f、下游引物ptv-r和荧光探针ptv-p的序列如下：
4、上游引物ptv-f：5'-tactcgttacgctggttttggattgtcttg-3'，
5、下游引物ptv-r：5'-cattacccagtcaggagtacttgctcttct-3'，
6、荧光探针ptv-p：
7、5'-ttatttggttgtagatttactggacccaccc(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)gaaagacctgctc(c3-spacer)3'；
8、荧光探针ptv-p具有4个修饰位点，距离5'端的≥35nt的中部位置标记一个碱基核苷酸类似物四氢呋喃(thf)，是核酸内切酶的识别位点；thf位点的上游标记一个荧光基团(fam)，下游标记一个淬灭基团(bhq1)，两个基团差距为2-4nt，在3’末端标记有聚合物延伸阻断基团亚磷酰胺c3-spacer。
9、上述一种荧光rt-raa引物探针组在制备检测猪捷申病毒的试剂盒中的应用。
10、一种用于检测猪捷申病毒的试剂盒，其包括上述的荧光rt-raa引物探针组，试剂盒中的上游引物ptv-f、下游引物ptv-r的工作浓度均为5μm，试剂盒中的荧光探针ptv-p的工作浓度为2μm。
11、上述一种试剂盒在检测猪捷申病毒中的应用，所述的应用不包括疾病治疗与诊断目的。
12、一种非疾病诊断治疗目的的检测猪捷申病毒的方法，其是提取待测样本的rna作为模板，使用上述的试剂盒进行rt-raa反应；
13、rt-raa反应体系为：
14、 试剂 使用量 蛋白酶冻干粉 1管 buffera 25μl ptv-f(5μm) 2μl ptv-r(5μm) 2μl ptv-p(2μm) 0.6μl rna样本 5μl <![cdata[ddh<sub>2</sub>o]]> 12.9μl bufferb 2.5μl 总体积 50.0μl
15、反应条件为：39℃1min；37℃30s(40个循环)。
16、本专利技术具有以下优点：
17、1、本专利技术提供的引物和探针，具有高度特异性和敏感性，能够满足ptv检测要求。
18、2、本专利技术的rt-raa检测方法，具有良好的重复性(变异系数＜5％)，具有时效性，反应只需21分钟即可获得检测结果。对收集的57份临床样品分别使用荧光rt-raa和rt-pcr方法检测，结果显示rt-raa检测方法的检出阳性率为8.78％(5/57)，与rt-pcr的检出阳性率一致(100％)，说明本专利技术的荧光rt-raa方法检测准确性可靠，可以在临床检测中应用。
19、3、本专利技术的rt-raa检测方法只需恒温37℃扩增，适合野外无特定实验条件的情况下使用，具有临床快检的优势。
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1.一种用于检测猪捷申病毒的荧光RT-RAA引物探针组，其特征在于：包括用于检测猪捷申病毒的上游引物PTV-F、下游引物PTV-R和荧光探针PTV-P，所述上游引物PTV-F、下游引物PTV-R和荧光探针PTV-P的序列如下：
2.如权利要求1所述的荧光RT-RAA引物探针组在制备检测猪捷申病毒的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测猪捷申病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的荧光RT-RAA引物探针组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的上游引物PTV-F、下游引物PTV-R的工作浓度均为5μM，所述试剂盒中的荧光探针PTV-P的工作浓度为2μM。
5.如权利要求3所述的试剂盒在检测猪捷申病毒中的应用，其特征在于：所述的应用不包括疾病治疗与诊断目的。
6.一种非疾病诊断治疗目的的检测猪捷申病毒的方法，其特征在于：提取待测样本的RNA作为模板，使用如权利要求3所述的试剂盒进行RT-RAA反应。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪捷申病毒的荧光rt-raa引物探针组，其特征在于：包括用于检测猪捷申病毒的上游引物ptv-f、下游引物ptv-r和荧光探针ptv-p，所述上游引物ptv-f、下游引物ptv-r和荧光探针ptv-p的序列如下：
2.如权利要求1所述的荧光rt-raa引物探针组在制备检测猪捷申病毒的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测猪捷申病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的荧光rt-raa引物探针组。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：陈秋勇，周伦江，王隆柏，陈如敬，吴学敏，车勇良，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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