1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法，属于兽用生物制品领域。本发明专利技术的1型禽腺病毒疫苗的制备方法包括1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞制备抗原、测定抗原的病毒含量、含量合格的抗原经灭活剂灭活、灭活检验合格的抗原与佐剂混合乳化制备疫苗等步骤。本发明专利技术的1型禽腺病毒蛋黄抗体的制备方法包括疫苗免疫产蛋鸡、收集高免蛋、提取抗体、测定效价等步骤。本发明专利技术制备的1型禽腺病毒疫苗具有抗原含量高、质量稳定等优点；本发明专利技术制备的1型禽腺病毒蛋黄抗体对1型禽腺病毒有很好的预防和治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽用生物制品领域，具体涉及1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法。
技术介绍
全病毒灭活疫苗是一种常用的预防畜禽传染病的兽用生物制品。生物组织繁殖病毒，获得的病毒经甲醛等灭活剂作用，使病毒失去复制、繁殖的能力，但保留免疫原性，此种灭活后的全病毒可作为抗原与佐剂混合乳化制备灭活疫苗。制备的灭活疫苗经性状检验、安全检验、效力检验等，符合质量标准的疫苗可上市使用。兽用生物制品中常用的治疗性抗体多为蛋黄抗体。蛋黄抗体是将抗原制成疫苗免疫产蛋鸡，采集针对该病具有中和能力的蛋黄，经过适当处理，接种易感动物，用于预防或治疗该病。所述蛋黄抗体有的经过简单的稀释、灭活后使用；有的经过了精制提纯、浓缩提高效价、冷冻干燥等深加工。商品化的蛋黄抗体是经过农业部批准的、具有生产文号的、经过深加工的、有质量保障的有效产品。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种1型禽腺病毒疫苗的制备方法；本专利技术的另一目的在于提供一种检验1型禽腺病毒疫苗效力的方法；本专利技术的再一目的在于提供一种1型禽腺病毒蛋黄抗体的制备方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种1型禽腺病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)将1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞进行培养，待50％-70％细胞出现细胞病变时收获细胞，即得到1型禽腺病毒抗原。(2)测定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于107.5TCID50/0.1mL的抗原用于后续制备疫苗。(3)1型禽腺病毒抗原经甲醛或二乙烯亚胺灭活后接种鸡胚肝细胞，并盲传若干代，对1型禽腺病毒抗原进行灭活检验判定是否灭活完全。(4)灭活完全的1型禽腺病毒抗原与矿物油佐剂混合，乳化制备疫苗；通过血清学方法或攻毒法检验疫苗效力，检验合格的疫苗即为1型禽腺病毒疫苗。所述的血清学方法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价；免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不低于1:000-1:10000，对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100，则检验合格。其中微量中和试验法包括如下步骤：1)用细胞生长液(含6％-10％新生牛血清的DMEM培养液)悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0.1mL/孔，37℃、5％CO2培养箱培养24小时，备用。2)将被检样品用细胞维持液(含2％-4％新生牛血清的DMEM培养液)做10倍系列稀释。3)1型禽腺病毒用细胞维持液稀释至100-1000TCID50/0.1mL。4)向步骤2)不同稀释度的样品中加入等体积100-1000TCID50/0.1mL的1型禽腺病毒，混匀，37℃孵育1小时。5)弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤(4)孵育得到的各混合液接种96孔细胞培养板，0.2mL/孔，每个稀释度6-8孔。6)接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数量，以Reed-Muench法计算被检样品中和效价。所述的攻毒法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴鼻点眼接种浓度为100-100000000TCID50/0.1mL的1型禽腺病毒液0.1mL；接种病毒后第5日以棉拭子沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5-1.0mL含1000单位/mL青霉素和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分离，对照鸡病毒分离为80％-100％阳性，免疫鸡病毒分离为80％-100％阴性；或接种病毒后10日内，对照鸡40％-100％死亡，免疫鸡90％-100％健活，则检验合格。其中病毒分离的方法法包括如下步骤：1)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为1000000-6000000个肝细胞/2mL/孔，37℃、5％CO2培养箱培养24小时，备用。2)棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中，弃去棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用。3)弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2-3mL细胞维持液，将0.3mL-0.5mL被检样品加入6孔板的其中一孔，37℃、5％CO2培养箱培养。4)接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况；用间接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE；出现特异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阴性。所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法的步骤(1)优选为：以14-17日龄鸡胚的肝脏为材料，用胰酶消化使鸡胚肝细胞分散，分散的鸡胚肝细胞悬浮于细胞生长液中，转入细胞培养瓶中37℃培养；待鸡胚肝细胞贴壁并生长至70％-100％铺满底壁时弃去细胞生长液，加入细胞维持液，接种1型禽腺病毒，37℃培养2-4天，待50％-70％细胞出现细胞病变时，收集细胞维持液，即得到1型禽腺病毒抗原。步骤(2)中所述的病毒含量测定的方法优选包括如下步骤：1)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0.1mL/孔，37℃、5％CO2培养箱培养24小时，备用。2)将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释。3)将96孔细胞培养板内的细胞生长液弃去，10-6、10-7、10-8、10-9稀释的被检样品接种96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个稀释度6-8个重复孔，置于37℃、5％CO2培养箱培养。4)接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数量，以Reed-Muench法计算被检样品TCID50含量。步骤(3)中所述的灭活的方法优选包括如下步骤：向抗原中加入终浓度0.05％-0.2％(v/v)的甲醛或终浓度5mM的二乙烯亚胺，37℃灭活16-32小时，加入终浓度5mM的硫代硫酸钠终止灭活。步骤(3)中所述的灭活检验的方法优选包括如下步骤步骤(3)中所述的灭活检验的方法包括如下步骤：取0.2-2mL灭活后的抗原接种培养了16-24小时的鸡胚肝细胞，作为F1代；F1代培养72小时如无细胞病变再接种培养了16-24小时的鸡胚肝细胞，作为F2代；F2代培养168小时如无细胞病变说明为被检抗原灭活完全。一种1型禽腺病毒疫苗，通过上述方法制备得到。一种检验1型禽腺病毒疫苗效力的方法，为血清学方法或攻毒法。所述的血清学方法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价；免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不低于1:000-1:10000，对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100，则检验合格。其中微量中和试验法包括如下步骤：1)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞进行培养，待50%‑70%细胞出现细胞病变时收获细胞，即得到1型禽腺病毒抗原；（2）测定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于107.5TCID50/0.1mL的抗原用于后续制备疫苗；（3）1型禽腺病毒抗原经甲醛或二乙烯亚胺灭活后接种鸡胚肝细胞，并盲传若干代，对1型禽腺病毒抗原进行灭活检验判定是否灭活完全；（4）灭活完全的1型禽腺病毒抗原与矿物油佐剂混合，乳化制备疫苗；通过血清学方法或攻毒法检验疫苗效力，检验合格的疫苗即为1型禽腺病毒疫苗；所述的血清学方法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10‑20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5‑10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价；免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不低于1:000‑1:10000，对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100，则检验合格；其中微量中和试验法包括如下步骤：1）用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000‑100000个肝细胞/0.1mL/孔，37℃、5% CO2培养箱培养24小时，备用；2）将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释；3）1型禽腺病毒用细胞维持液稀释至100‑1000TCID50/0.1mL；4）向步骤2）不同稀释度的样品中加入等体积100‑1000TCID50/0.1mL的1型禽腺病毒，混匀，37℃孵育1小时；5）弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤（4）孵育得到的各混合液接种96孔细胞培养板，0.2mL/孔，每个稀释度6‑8孔；6）接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数量，以Reed‑Muench法计算被检样品中和效价；所述的攻毒法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10‑20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5‑10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴鼻点眼接种浓度为100‑100000000TCID50/0.1mL的1型禽腺病毒液0.1mL；接种病毒后第5日以棉拭子沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5‑1.0mL含1000单位/mL青霉素和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分离，对照鸡病毒分离为80%‑100%阳性，免疫鸡病毒分离为80%‑100%阴性；或接种病毒后10日内，对照鸡40%‑100%死亡，免疫鸡90%‑100%健活，则检验合格；其中病毒分离的方法包括如下步骤：1）用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为1000000‑6000000个肝细胞/2mL/孔，37℃、5% CO2培养箱培养24小时，备用；2）棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中，弃去棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用；3）弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2‑3mL细胞维持液，将0.3mL‑0.5mL被检样品加入6孔板的其中一孔，37℃、5% CO2培养箱培养；4）接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况；用间接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE；出现特异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞进行培养，待50%-70%细胞出现细胞病变时收获细胞，即得到1型禽腺病毒抗原；（2）测定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于107.5TCID50/0.1mL的抗原用于后续制备疫苗；（3）1型禽腺病毒抗原经甲醛或二乙烯亚胺灭活后接种鸡胚肝细胞，并盲传若干代，对1型禽腺病毒抗原进行灭活检验判定是否灭活完全；（4）灭活完全的1型禽腺病毒抗原与矿物油佐剂混合，乳化制备疫苗；通过血清学方法或攻毒法检验疫苗效力，检验合格的疫苗即为1型禽腺病毒疫苗；所述的血清学方法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价；免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不低于1:000-1:10000，对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100，则检验合格；其中微量中和试验法包括如下步骤：1）用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0.1mL/孔，37℃、5% CO2培养箱培养24小时，备用；2）将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释；3）1型禽腺病毒用细胞维持液稀释至100-1000TCID50/0.1mL；4）向步骤2）不同稀释度的样品中加入等体积100-1000TCID50/0.1mL的1型禽腺病毒，混匀，37℃孵育1小时；5）弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤（4）孵育得到的各混合液接种96孔细胞培养板，0.2mL/孔，每个稀释度6-8孔；6）接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数量，以Reed-Muench法计算被检样品中和效价；所述的攻毒法包括如下步骤：取3～4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴鼻点眼接种浓度为100-100000000TCID50/0.1mL的1型禽腺病毒液0.1mL；接种病毒后第5日以棉拭子沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5-1.0mL含1000单位/mL青霉素和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分离，对照鸡病毒分离为80%-100%阳性，免疫鸡病毒分离为80%-100%阴性；或接种病毒后10日内，对照鸡40%-100%死亡，免疫鸡90%-100%健活，则检验合格；其中病毒分离的方法包括如下步骤：1）用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为1000000-6000000个肝细胞/2mL/孔，37℃、5% CO2培养箱培养24小时，备用；2）棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中，弃去棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用；3）弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2-3mL细胞维持液，将0.3mL-0.5mL被检样品加入6孔板的其中一孔，37℃、5% CO2培养箱培养；4）接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况；用间接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE；出现特异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阴性。2.根据权利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（1）为：以14-17日龄鸡胚的肝脏为材料，用胰酶消化使鸡胚肝细胞分散，分散的鸡胚肝细胞悬浮于细胞生长液中，转入细胞培养瓶中37℃培养；待鸡胚肝细胞贴壁并生长至70%-100%铺满底壁时弃去细胞生长液，加入细胞维持液，接种1型禽腺病毒，37℃培养2-4天，待50%-70%细胞出现细胞病变时，收集细胞维持液，即得到1型禽腺病毒抗原。3.根据权利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的病毒含量测定的方法包括如下步骤：1）用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0.1mL/孔，37℃、5% CO2培养箱培养24小时，备用；2）将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释；3）将96孔细胞培养板内的细胞生长液弃去，10-6、10-7、10-8、10-9稀释的被检样品接种96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个稀释度6-8...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晶梅，漆世华，谢红玲，温文生，朱薇，秦红刚，冯钊，王焕君，王碧群，靖志强，李婷婷，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42