一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体制造技术

本发明专利技术提供一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体,是用保藏编号为CCTCC NO:V201620的番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原制备的。本发明专利技术用番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV‑M株接种番鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制得到抗体。制备的抗体能预防小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染，此卵黄抗体具有高效、安全性好、保护率高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体。
技术介绍
鹅细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称鹅流感、鹅或小鹅瘟、鹅肝炎、鹅肠炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样性反映了该病多个病理学特征。根据感染雏鹅、雏鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急性和慢性型。急性型可引起10日龄以内的雏鹅100%死亡。许多国家也报道了一种抗原性完全不同的番鸭细小病毒感染，死亡率高达80%。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于20世纪60年代中后期出现于中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为鹅细小病毒感染，但是通过病毒中和试验、分子生物学研究证明，从鹅和番鸭分离到的细小病毒有明显的差异。如果对死亡的番鸭处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害。目前市场上仅有番鸭细小病毒病活疫苗，还没有番鸭源鹅细小病毒病的活疫苗销售，且尚无快速有效的药物或方法来防治番鸭源鹅细小病毒病。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体，提供的卵黄抗体具有效价高、保护率高、安全性好等优点。本专利技术所提供的用于预防、治疗番鸭源小鹅瘟（番鸭源鹅细小病毒病）的卵黄抗体，是用保藏编号为CCTCC NO:V201620的番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原制备的。使用的番鸭源小鹅瘟病毒，为番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:V201620。本专利技术的卵黄抗体，其制备包括如下的步骤1）用番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原，制成灭活疫苗；2)将制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，来获得用番鸭源小鹅瘟病毒免疫后的鸡蛋；3）将免疫后的鸡蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活制成卵黄抗体。本专利技术制备的抗体在制备预防或治疗鹅细小病毒病的制品中的应用；本专利技术用番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株接种番鸭胚，分别收获死亡胚胚体
和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制得到抗体。制备的抗体能预防小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染，此卵黄抗体具有高效、安全性好、保护率高等优点。附图说明图1：基于VP基因的YBGPV-M与国内外已公布的GPV毒株遗传进化树图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。本专利技术所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本专利技术实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本专利技术。实施例1、YBGPV-M株的筛选2013年从福建省某鸭场的雏番鸭群中出现了以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征的疫病，发病率50%～80%，病死率45%～70%，临床上使用抗菌素、番鸭细小病毒病疫苗及番鸭细小高免卵黄抗体均不能控制病情。专利技术人无菌采集濒死鸭的肝脏、脾脏及胰腺，将肝脏、脾脏及胰腺用无菌生理盐水匀浆制成20%悬液，3000r/min离心15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，孵化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为106.50ELD50/0.2ml,最小免疫剂量为102.0ELD50/0.2ml，该病毒仅与小鹅瘟病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:V201620。对于本专利技术筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无囊膜，直径在20～22nm左右、对理化因素的灭活作用有很强的抵抗力65℃加热处理30min病毒滴度不受影响，37℃作用1小时仍稳定，对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起雏番鸭发生以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征疫病。该毒株制备的疫苗免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月以上；免疫成年番鸭后，能保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量番鸭源小鹅瘟病毒抗血清中和，接种11日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病毒对照组番鸭胚全部死亡。对筛选鉴定的YBGPV-M株的结构蛋白基因VP进行了测序,VP基因全长
2199bp，编码约732个氨基酸；将其与GenBank中收录的30个GPV VP基因序列进行遗传进化树（图1）及核苷酸序列同源性分析，发现本专利技术获得YBGPV-M株VP基因与另外30个GPV毒株的VP基因同源性介于85.9％～90.3％之间；结果表明筛选病毒的VP蛋白与已报道的小鹅瘟病毒VP基因存在着氨基酸差异。实施例2、疫苗的制备1制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体（去掉头和四肢）放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:3加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。表1：毒液的制备毒株名称制苗材料接种胚数（枚）胚日龄收获毒液（ml）YBGPV-M株番鸭胚1001134002.灭活将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。3.疫苗半成品检验（1）无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。（2）病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50为106.67ELD50/0.2ml。（3）灭活检验将病毒液尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。二、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计，参见表2）。（1）油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后
备用。（2）水相制备将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBGPV-M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是用保藏编号为CCTCCNO:V201620的番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原制备的。

【技术特征摘要】
1.一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是用保藏编号为CCTCCNO:V201620的番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原制备的。2.如权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的番鸭源小鹅瘟病毒为番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株。3.权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备方法如下：1)用番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹敏，吴发兴，韩乃君，范根成，杜元钊，郭莉莉，陶晓珊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37