禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法及其用途技术

本发明专利技术涉及禽蛋制备卵黄抗体领域，公开了一种禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，包括以下步骤：(1)将禽腺病毒Ⅳ型油乳灭活苗为抗原免疫健康母鸡，并收集被免疫母鸡所产的鸡蛋；(2)将所述免疫母鸡所产鸡蛋中的卵黄分离得到水溶性组分液；(3)将所述卵黄分离得到水溶性组分液加入至双水相系统，所述双水相系统包括25wt％～28wt％的聚乙二醇和20wt％～25wt％的柠檬酸钠，得到水溶性组分混合液；(4)对上述水溶性组分混合液进行分离纯化。本发明专利技术提供了一种抗体纯度高、得率高、对活性无影响的禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法。

Avian adenovirus type IV egg yolk antibody extraction method and use thereof

The present invention relates to the field of egg yolk antibody preparation and discloses a method for extracting avian adenovirus type IV yolk antibody, which comprises the following steps: (1) the aviadenovirus type oil emulsion inactivated vaccine immunized healthy hen, and collected by the immune hens egg; (2) the immune egg yolk in the separated water soluble component liquid; (3) the yolk separated water-soluble component was added to the aqueous two-phase system, the aqueous two-phase system including sodium citrate 25wt% 25wt% ~ 28wt% ~ 20wt% and polyethylene glycol, water soluble component mixed liquid; (4) the water soluble liquid mixtures were separated and purified. The invention provides an extraction method of avian adenovirus type IV egg yolk antibody with high antibody purity, high yield and no influence on activity.

【技术实现步骤摘要】
禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法及其用途
本专利技术涉及禽蛋制备卵黄抗体领域，具体涉及禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法及其用途。
技术介绍
I群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属。Ⅱ群(火鸡出血性肠炎和相关病毒)和Ⅲ群(减蛋综合症)禽腺病毒与疾病的关系明确，相比之下，大多数I群的禽腺病毒对禽类的致病作用还未完全确定。但FAdV-1和FAdV-4明显属于例外，其中FAdV-1能引起鹌鹑支气管炎，FAdV-4是心包积水肝炎综合征的主要病因。当鸡的健康受到损害时，如并发感染鸡传染性贫血病毒(CIAV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)等其他病原，其他的禽腺病毒株可使条件性致病源发生快速感染。I群禽腺病毒已经鉴定了5个禽腺病毒，其名称用字母A～E表示。每个种内的病毒主要根据交叉中和实验结果进一步分为不同的血清型。病毒颗粒直径为70～nm，无囊膜，呈20面体对称结构。病毒核酸为双股DNA，占整个病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分为蛋白质。病毒六邻体是主要的衣壳蛋白，含有型、群和群异性抗原决定簇，因而感染后可产生相应的型，群和群的特异性抗体。卵黄抗体是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。抗体又称免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒、中和毒素等免疫活性。还能够调理、凝集和沉淀抗原，激活补体。在疫病爆发时可用于紧急治疗。此蛋白类大分子用于治疗时必须与其生物活性密切相关，因此在提取时必须保证其生物活性的稳定。大量生产高活性抗体对于治疗免疫疾病具有重要的价值和广阔的市场前景。目前提取卵黄抗体的方法有很多种：1、酸化水提取法：将卵黄与纯化水按一定比例混合后，用盐酸调节PH值，通过静置离心收集上清液，来达到收集卵黄抗体的效果。但是这种方法收集的卵黄抗体含量较低，不能完全体现卵黄的真正抗体含量。2、聚乙二醇提取法：将卵黄与PBS缓冲液按一定比例混合后，加入一定比例的聚乙二醇粉末，然后静置，10000r/min离心。聚乙二醇溶于水中不会发热、升温，不会引起蛋白质变性，沉淀蛋白质的时间较短且不影响离心处理，并有促进蛋白质结晶的作用，但聚乙二醇易溶于水，而且需要用到10000r/min离心，在耗费成本的同时也不能有效去除聚乙二醇，抗体得率也不高。3、辛酸萃取法：向用酸化水法提取的IgY溶液中缓慢加入终浓度为1％的正辛酸，搅拌10min，放入冰箱中冷冻10min，抽滤得IgY溶液。该方法与聚乙二醇法相似，但辛酸在水中溶解度极低(0.062g/L)，因此在水溶性物质中辛酸残留量极微。但是这种方法需要冷冻抽滤，而且抗体含量不是很高。4、普通氯仿提取法：将卵黄、生理盐水、氯仿按一定的比例混匀后室温放置30min，3000r/min离心20min，溶液分成3层，下层为有机溶剂，中间层为变性脂蛋白，上层为提取的IgY溶液。这种方法需要使用到离心机，而且不一定100％能分层，在室温低下非常难析出大量的IgY溶液。因此，对于本领域技术人员来说，选用一种即能分离出含有大量卵黄抗体又要工艺简单能够适于工业化生产的提取卵黄抗体的方法成了一个技术难题。因此，对于本领域技术人员来说，找到一种既能分离出含大量卵黄抗体，又能适合工业化生产的工艺简单、节人成本的简易提取卵黄抗体的方法是亟待解决的问题。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的生产卵黄抗体纯度低、制备繁锁、活性低的缺陷，从而提供一种抗体纯度高、对活性无影响，得率高的禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法。为此，本专利技术的禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，包括以下步骤：(1)将禽腺病毒Ⅳ型油乳灭活苗为抗原免疫健康母鸡，并收集被免疫母鸡所产的鸡蛋；(2)将所述免疫母鸡所产鸡蛋中的卵黄分离得到水溶性组分液；(3)将所述卵黄分离得到水溶性组分液加入至双水相系统，所述双水相系统包括25wt％～28wt％的聚乙二醇和20wt％～25wt％的柠檬酸钠，得到水溶性组分混合液；(4)对上述水溶性组分混合液进行分离纯化。可选地，所述水溶性组分混合液中还包括0.05wt％～0.30wt％的Nacl。可选地，所述步骤(2)具体包括：对被免疫鸡蛋的蛋壳进行消毒处理；取被免疫鸡蛋的卵黄并加入所述卵黄重量8～10倍的双蒸水制成卵黄稀释液；使用0.1mol/LHCl调节卵黄稀释液的pH值至5～7；放置于4℃～6℃环境下搅拌7～9小时；将搅拌后的卵黄稀释液在4℃～6℃的温度下离心，得到卵黄抗体水溶性组分液上清液。可选地，取被免疫鸡蛋的卵黄时，还包括使用无菌NS将蛋壳内的残余蛋清洗出来。可选地，步骤(1)中免疫健康母鸡采用注射免疫，具体为4点注射为，肌肉一点，胸部一点，两翼下各一点，首次免疫后的第7天及第14天进行加强免疫。可选地，步骤(4)离心后分为三层，上层为聚乙二醇层，下层为柠檬酸钠层，中间层为盐析出的抗体层，还包括在该中间层中加入0.05％的蔗糖进行冷冻干燥的步骤。可选地，当柠檬酸钠的浓度为20wt％时，卵黄稀释液的pH值为5.1，聚乙二醇的分子量为2000，Nacl浓度为2.5wt％。可选地，所述柠檬酸钠的pH值为8.0。根据所述的腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法所得抗体制成微胶囊。根据上述方法或产品在治疗制备禽类鸡传染性贫血病毒(CIAV)和传染性法氏囊病病毒的药物中的用途。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术实施例提供的禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，卵黄抗体通过禽腺病毒Ⅳ型油乳灭活苗为抗原免疫健康母鸡而得，具有特异性强，效价高的特点。上述卵黄抗体是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。2.本专利技术实施例提供的禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，提取环境和条件温和、非致变性，能够获得高纯度的抗体，所得抗体得率在90％以上，较传统方法大大提高，上述方法获得抗体的成本低，可以大规模的生产，易于产业化，且扩大生产后得率不改变，具有重要的价值和广阔的市场前景。具体实施方式下述各实施例中使用的抗原的制备方法为：禽腺病毒Ⅳ型菌在液体培养基中扩增培养至菌液浓度107～109CFU/mL，收集菌体，用PBS稀释后油乳灭活，得到灭活的禽腺病毒Ⅳ型。实施例1本实施例提供一种禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，包括以下步骤：S1.选择健康的17-18周龄海兰褐鸡3只，将免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳灭活疫苗)注射到海兰褐鸡体内，每只免疫注射量为0.5ml，免疫注射部位为4点注射，分别为胸部一点，两翼下各一点，肌肉一点共四点，首次免疫后的第7天及14天进行加强免疫，免疫剂量与方法与首次免疫相同；S2.免疫结束后收集鸡蛋，收集从最后一次免疫算起，将收集的鸡蛋编号并做好记录，并于4℃冰箱保存备用，收集海兰褐鸡未免疫鸡蛋为阴性对照；S3.将免疫母鸡所产鸡蛋中的卵黄分离得到水溶性组分液的具体步骤如下：先用75％酒精将收集的鸡蛋浸泡5分钟，对外壳进行消毒处理；取出鸡蛋用清水冲洗，用无菌纱布将蛋壳擦干；将蛋壳打开一个小孔，让蛋清缓慢流出，直至蛋清流尽，使用无菌NS将蛋壳内的残余蛋清洗出来；打开蛋壳，小本文档来自技高网...

【技术保护点】
禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将禽腺病毒Ⅳ型油乳灭活苗为抗原免疫健康母鸡，并收集被免疫母鸡所产的鸡蛋；(2)将所述免疫母鸡所产鸡蛋中的卵黄分离得到水溶性组分液；(3)将所述卵黄分离得到水溶性组分液加入至双水相系统，所述双水相系统包括25wt％～28wt％的聚乙二醇和20wt％～25wt％的柠檬酸钠，得到水溶性组分混合液；(4)对上述水溶性组分混合液进行分离纯化。

【技术特征摘要】
1.禽腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将禽腺病毒Ⅳ型油乳灭活苗为抗原免疫健康母鸡，并收集被免疫母鸡所产的鸡蛋；(2)将所述免疫母鸡所产鸡蛋中的卵黄分离得到水溶性组分液；(3)将所述卵黄分离得到水溶性组分液加入至双水相系统，所述双水相系统包括25wt％～28wt％的聚乙二醇和20wt％～25wt％的柠檬酸钠，得到水溶性组分混合液；(4)对上述水溶性组分混合液进行分离纯化。2.根据权利要求1所述的腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，其特征在于，所述水溶性组分混合液中还包括0.05wt％～3.0wt％的Nacl。3.根据权利要求1或2所述的腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：对被免疫鸡蛋的蛋壳进行消毒处理；取被免疫鸡蛋的卵黄并加入所述卵黄重量8～10倍的双蒸水制成卵黄稀释液；使用0.1mol/LHCl调节卵黄稀释液的pH值至5～7；放置于4℃～6℃环境下搅拌7～9小时；将搅拌后的卵黄稀释液在4℃～6℃的温度下离心，得到卵黄抗体水溶性组分液上清液。4.根据权利要求3所述的腺病毒Ⅳ型卵黄抗体的提取方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳枝，丛桂海，于海龙，
申请(专利权)人：青岛奕奕和农牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37