本发明专利技术涉及一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法，将微囊藻毒素LR偶联血蓝蛋白KLH，得到微囊藻毒素LR‑血蓝蛋白MC‑LR‑KLH；将上述MC‑LR‑KLH作为免疫抗原免疫蛋鸡，得到抗微囊藻毒素LR免疫蛋；敲破抗微囊藻毒素LR免疫蛋，只留取蛋黄部分，提纯，冷冻干燥，即得。本发明专利技术获得的抗体可用于微囊藻藻毒素LR的检测，具有较好的经济效益和社会效益，具有较好的运用前景。
Method for preparing egg yolk antibody against microcystin LR
The invention relates to a preparation method of an anti microcystin LR yolk antibody of microcystin LR coupling hemocyanin KLH by microcystin LR hemocyanin MC LR KLH; the MC LR KLH as hens immunized with antigen obtained anti microcystin LR immunity eggs Qiaopo; anti microcystin LR immune egg, leaving only take egg yolk, purification, freeze drying, namely. The antibody obtained by the invention can be used for the detection of microcystin LR, has good economic and social benefits, and has good application prospect.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于卵黄抗体的制备领域，特别涉及一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法。
技术介绍
微囊藻毒素(Microcystin，简称MC)是蓝藻产生的一类次生代谢产物，属于细胞内毒素，细胞死亡后或细胞膜通透性增强时释放入水，在蓝藻水华暴发中常大量产生且对生态系统易造成严重危害，被微囊藻毒素污染的饮用水和水产品给人类健康带来了巨大威胁。从全球范围来看，由7个氨基酸组成的微囊藻毒素是淡水环境中最常见的蓝藻毒素，为环状结构(-D-Ala-L-X-D-Masp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)，目前至少已知有微囊藻毒素80余种变型，分子量均在1000左右，其中3种组合的藻毒素毒性最强：分别为LR、RR和YR，其中L、R、Y分别代表Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Tyr(酪氨酸)，MC-LR的分子式为C49H74N10O12，分子量为995.2，LR的结构式如图1。微囊藻毒素具有水溶性，易溶于水、甲醇或丙酮，在水中的溶解性大于1ppm。微囊藻毒素有很高的耐热性，加热煮沸都不能将毒素破坏，也不能将其去除。相关研究显示，即使在300℃高温下微囊藻毒素仍然可以保留一部分活性；自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯等常规工艺也不能将其去除。微囊藻毒素不易挥发，抗pH变化，在水中藻毒素自然降解过程是十分缓慢的，其化学性质相当稳定。微囊藻毒素是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈促癌剂，具有很大危害性，人类及野生动物饮用了含微囊藻毒素的水后，会出现腹泻、乏力、厌食、呕吐、嗜睡、口眼分泌物增多等症状，甚至死亡；人们在洗澡、游泳及其他水上休闲和运动时，皮肤接触含藻毒素水体可引起敏感部位(如眼睛)和皮肤过敏；长期饮用则可能引发肝癌。MC-LR对人的半致死剂量(LD50)约为50～100ppb。医学部门已发现饮水中微量囊藻毒素与人群中原发性肝癌的发病率有很大相关性。当水体严重富营养化时，产毒蓝藻往往大量暴发，微囊藻毒素就会产生并释放到水体中，世界上25％～70％的蓝藻水华污染可产生藻毒素。微囊藻毒素是细胞内毒素，在细胞内合成，由肽合成酶复合体合成的生物活性小肽，细胞破裂后释放出来并表现出毒性。微囊藻毒素的合成受光照、温度、营养盐等多种环境因素影响，其中光照可能起着非常重要的作用，低光强下温度才影响毒素的产生，在营养盐中以磷的作用较明显。各种浮游动物能食用微囊藻，且微囊藻毒素能在甲壳纲的水生动物虾类和贝类的消化腺内积累，并沿食物链进入到高营养级生物体内，包括鱼、鸟、哺乳动物及人类，微囊藻毒素在食物链逐级积累的过程中浓度逐渐放大，以致产生致命的毒害性。世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的藻毒素标准为1.0ppb。各国已有饮水中的藻毒素含量标准一般都为微囊藻毒素LR的含量，加拿大健康组织规定饮水中可接受的藻毒素标准为0.5ppb，澳大利亚学者建议1ppb的含量为安全饮用水的上限。国内微囊藻毒素的标准检测国标主要有：GB/T5750.8—2006、GB/T20466—2006、GB3838—2002、HJ/T91—2002]。《水中微囊藻毒素的测定》(GB/T20466—2006)中规定了微囊藻毒素LR、微囊藻毒素RR的测定和微囊藻毒素YR的两种测定方法；《饮用水的有机标准》(GB/T5750.8—2006)中规定了微囊藻毒素LR和微囊藻毒素RR的检测方法；《地表水环境质量标准》(GB3838—2002)中规定了微囊藻毒素LR的标准限值和最低检出限，分别为1和0.01ppb；《地表水和污水监测技术规范》(HJ/T91—2002)中规定了微囊藻毒素-LR的最低检出浓度为1ppb。目前最常用的两种测定方法分别为高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。目前，卵黄抗体研制技术正成为国内外医药领域的新热点。卵黄中的卵黄抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血液抗体浓度的水平(Larsson等，1993)，(Hatta等，1993)，一羽高产蛋禽产蛋期每月大约可产1500mg卵黄抗体(Schade等，1994)。卵黄抗体的化学本质是蛋白质，发挥作用后即可被机体作为营养物质分解利用，纯品不会残留任何有害物质；而且稳定性较好，能耐酸、耐碱、耐热、耐酶解(Shimizu等，1992)，可制成方便保存和运输的卵黄抗体粉，是一种理想的绿色生物制品。目前IgY技术在国内研究与应用的大体情况是：在兽医学和功能食品开发上比较受重视，甚至较许多西方国家更加重视产品开发和商品化。但IgY技术应用的基础研究工作还比较薄弱，其剂型研究几乎无人涉及，这也成为IgY普遍应用的“瓶颈”。卵黄抗体在检测方面的运用越来越广泛。由于lgY是从鸡蛋黄中提取的免疫球蛋白，不但分子质量和等电点不同于哺乳动物的lgG免疫球蛋白，而且不与哺乳类动物的血清补体和Fc段结合，不受类风湿因子的干扰，从而可避免上述假阴性和假阳性结果结免疫学实验带来的干扰。在免疫检测中可提高检测的特异性及敏感性。IgY这一独特的生物学特性，使其在免疫检测领域有很大的应用潜力。实验证实了lgY在免疫沉淀、免疫电泳、酶联免疫反应、免疫电镜和免疫印迹取代传统哺乳动物IgG的可行性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法，本专利技术获得的抗体可用于微囊藻藻毒素LR水体检测，具有较好的经济效益和社会效益，具有较好的运用前景。本专利技术的一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法，包括：(1)将MC-LR-KLH作为免疫抗原免疫蛋鸡，得到抗微囊藻毒素LR免疫蛋；(2)敲破抗微囊藻毒素LR免疫蛋，只留取蛋黄部分，提纯，冷冻干燥，即得抗微囊藻毒素LR卵黄抗体。所述步骤(1)MC-LR-KLH的制备具体为：将微囊藻毒素LR偶联血蓝蛋白KLH，得到微囊藻毒素LR-血蓝蛋白MC-LR-KLH，具体偶联方法是：3mg微囊藻毒素溶于1.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入100mL活化液(12mgEDC，终浓度0.1mol/LHCl和7mgNHS溶于1mLDMF中)，4℃活化反应过夜。取20mgKLH于5mLpH9.6的碳酸缓冲液,搅拌并置于冰水浴中，将上述活化后的微囊藻毒素逐滴加入，加完后继续搅拌1h，然后4℃放置过夜。用0.01MPBS透析3天,离心取上清，用lorry法测定浓度为1.4mg·mL–1，–20℃保存，得到MC-LR-KLH用作免疫抗原。所述步骤(1)中MC-LR-KLH为免疫抗原免疫蛋鸡具体为：制备免疫原：将MC-LR-KLH与费氏完全佐剂按体积比为1:1混合作为免疫原1；将MC-LR-KLH与费氏不完全佐剂1:1(体积比)混合作为免疫原2；用0.01MPBS溶解的MC-LR-KLH(体积比为1:1)，作为免疫原3；免疫程序如下：28周龄罗曼蛋鸡进行翅静脉采血作为对照血清，开产后收集鸡蛋作为实验对照。开产后第3天进行首次免疫，首次免疫用免疫原1进行，剂量0.5mg/只，首次免疫后1周进行二免，二免用免疫原2，免疫剂量1.0mg/只，二免后都用免疫原3进行，二免后每隔20d加强免疫，连续免疫2次，免疫剂量均为1.0mg/只，40d后，再进行免疫，免疫剂量为2.0mg/只，从免疫鸡产蛋开始，每天收集所有鸡蛋，每次免疫后7天翅静脉采血分离血清。用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法，包括：(1)将MC‑LR‑KLH作为免疫抗原，免疫蛋鸡，得到抗微囊藻毒素LR免疫蛋；(2)敲破抗微囊藻毒素LR免疫蛋，只留取蛋黄液部分，提纯，冷冻干燥，即得抗微囊藻毒素LR卵黄抗体。
【技术特征摘要】
1.一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法，包括：(1)将MC-LR-KLH作为免疫抗原，免疫蛋鸡，得到抗微囊藻毒素LR免疫蛋；(2)敲破抗微囊藻毒素LR免疫蛋，只留取蛋黄液部分，提纯，冷冻干燥，即得抗微囊藻毒素LR卵黄抗体。2.根据权利要求1所述的一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中MC-LR-KLH为免疫抗原免疫蛋鸡具体为：将MC-LR-KLH与费氏完全佐剂按体积比为1:1混合作为免疫原1；将MC-LR-KLH与费氏不完全佐剂按体积比为1:1混合作为免疫原2；用0.01MPBS溶解MC-LR-KLH，其中体积比为1:1，作为免疫原3；首次免疫用免疫原1进行，剂量0.5mg/只，首次免疫后1周进行二免，二免用免疫原2，免疫剂量1.0mg/只，二免后都用免疫原3进行，二免后每隔20d加强免疫，连续免疫2次，免疫剂量均为1.0mg/只，40d后，再进行免疫，免疫剂量为2.0mg/只，从首次免疫开始，每天收集所有鸡蛋，然后用间接ELISA检测收集鸡蛋的抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的效价，效价超过1:5120的鸡蛋作为抗微囊藻毒素LR免疫蛋。3.根据权利要求1所述的一种抗微囊藻毒素LR卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中提纯具体为：蛋黄液中加入乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌，4℃条件下静置过夜，离心，取上清液过滤，得到滤液，然后滤液中加入PEG6000...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹军，朱春锋，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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