一种用于卵黄抗体制备的中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因原核表达，根据大肠杆菌对密码子的偏好性获得的稀有密码子改造的中华蜜蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因，是SEQ ID No.1所示。优点是：通过优化改造了中华蜜蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因。改造的VP2基因经原核表达，能产生大量VP2蛋白，用VP2免疫鸡制备的卵黄抗体，可用于防治中蜂囊状幼虫病，且疗效显著。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于卵黄抗体制备的中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因原核表达。
技术介绍
中华蜜蜂已被列入国家畜禽遗传资源保护名录，也是辽宁省十大畜禽遗传资源保护品种之一，是我国宝贵的地方蜂种资源，饲养中蜂也已成为山区农民发家致富的有效途径。中蜂对保持我国植物生态系统具有不可替代的作用，研究表明一旦中蜂灭绝，我国将有30％的植物灭绝，目前因中蜂的减产，导致一些国家级二级保护植物濒临灭绝。近年来各地为加强中蜂业的发展，已经建立了中蜂保护区，然而，目前因中蜂囊状幼虫病的发生，已经给中蜂业造成了毁灭性的打击。1972年中蜂囊状幼虫病在广东大流行，不到半年蔓延至大半个中国，中蜂损失约百万群，严重制约了中蜂产业的发展。目前，虽然有中药用于中蜂囊状幼虫病的治疗，但中药治疗主要是通过免疫调节作用，间接抗病毒，并不能直接杀死病毒，相对起效慢，同时由于中药有味也往往使得蜜蜂不能很好的采食，甚至于发生逃逸，尤其是对重病蜂群治愈效果较差。鉴于此，CN102504023A公开了一种用中蜂囊状幼虫病毒制备卵黄抗体的制备方法，然而由于中蜂囊状幼虫病毒至今还没有适合培养体系，无法实现其在体外人工繁殖，直接限制了卵黄抗体的批量生产和应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题提供一种实现在制备卵黄抗体的免疫原制备，实现其在体外人工繁殖，使卵黄抗体可批量生产的用于卵黄抗体制备的中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因原核表达。本专利技术的技术解决方案是：一种用于卵黄抗体制备的中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因原核表达，其特殊之处在于：根据大肠杆菌对密码子的偏好性获得的稀有密码子改造的中华蜜蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因，是SEQIDNo.1所示。本专利技术的有益效果：通过优化改造了中华蜜蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因。改造的VP2基因经原核表达，能产生大量VP2蛋白，用VP2免疫鸡制备的卵黄抗体，可用于防治中蜂囊状幼虫病，且疗效显著。附图说明图1是重组质粒双酶切鉴定图谱；图中：M:DNA相对分子质量标准；1,2:质粒pET-28a-optiVP2的双酶切产物；图2是optiVP2融合蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳图；图中：M:蛋白质相对分子质量标准；1:pET-28a-optiVP2诱导表达产物；2:pET-28a空载体；图3是不同诱导时间optiVP2融合蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳图；图中：1:蛋白质相对分子质量标准；2:4h诱导表达结果；3:4.5h诱导表达结果；4:5h诱导表达结果；5:5.5h诱导表达结果；6:6h诱导表达结果7:6.5h诱导表达结果；8:7h诱导表达结果；9:7.5h诱导表达结果；图4是optiVP2重组蛋白Western-blot分析；图中：M:蛋白质相对分子质量标准；1:阴性对照；2:pET-28a-optiVP2诱导表达产物图5是纯化后optiVP2重组蛋白SDS-PAGE分析；图中：M:蛋白质相对分子质量标准；1:凝胶扩散法纯化VP2融；2-3:对上清进行亲和层析纯化；4-5:对沉淀进行亲和层析纯化；图6是抗VP2卵黄抗体特异性验证；A:第一组；B:第二组；C:第三组。具体实施方式实施例1以中华蜜蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因为依据，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，并在确保表达蛋白质的氨基酸序列不变的情况下，进行了密码子改造，获得了稀有密码子改造的VP2基因，是SEQIDNo.1所示。实施例2一、材料与方法1.1材料CSBV毒株(GenBank登录号：HM237361.1)从辽宁省宽甸地区某蜂场分离，由本实验室保存；总RNA提取试剂盒由美国Promega生产；原核表达载体pET-28a(暨南大学王宏教授惠赠)；低相对分子质量蛋白marker、AMV反转录酶、DNA连接试剂盒由大连宝生物公司生产；质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒和BIOTECH，His·band蛋白纯化试剂盒购自德国Novagen公司；抗CSBV卵黄抗体(由本实验室保存)；HRP标记兔抗鸡IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。方法1.2.1构建表达质粒利用生物信息学软件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，根据大肠杆菌密码子偏嗜性，对CSBVwtVP2基因的密码子进行优化。同时在优化后的VP2基因两端分别添加了BamHI和XhoI酶切位点。优化后的VP2由大连宝生物公司合成，并命名为optiVP2。将其克隆至质粒pET-28a中，构建得到VP2基因优化后的重组质粒pET-28a-optiVP2。表达目的蛋白1.2.2.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备取5ml大肠杆菌BL21于5mL离心管中，冰浴10min。在4℃于4000g离心10min，弃尽上清。加入0.1M的冰冷CaCl2水溶液0.5ml重悬菌体。冰浴20min，在4℃以4000g离心10min，弃尽上清。加入0.1M的冰冷CaCl2水溶液0.2mL重悬菌体。于4℃放置16h备用。1.2.2.2重组质粒转化大肠杆菌BL21取10μL重组质粒pET-28a-optiVP2加入200μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90s，再冰浴90s，加入37℃预热的不含卡那霉素的LB液体培养基800μL，37℃200rpm振荡培养1h，取200μL培养液均匀涂在含卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，凉干后37℃倒置培养16h，结果出现抗性菌落。1.2.2.3重组质粒的酶切鉴定将长出的菌落分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中。在37℃140rpm振荡过夜。在作好标记的每个试管中取5mL菌液提质粒(按照高纯度质粒小提试剂盒操作进行)。用限制性内切酶BamhI和XhoI双酶切鉴定，酶切反应如下：在灭菌的0.5mLEppendorf管中加重组质粒DNA2μg，10×酶切缓冲液2μL，限制性内切酶BamhI和XhoI各1μl，最后加水至总体积为20μL，在37℃保温6h。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见与理论值一致的约5300bp的载体片段和699bp目的基因片段(如图1)，表明重组质粒转化到大肠杆菌BL21中。1.2.2.4IPTG诱导表达从含有pET28a空质粒的阴性单菌落的平板上和步骤1.2.2.2获得的固体培养基上分别挑取含有pET28a空质粒的阴性单菌落和含重组质粒pET-28a-optiVP2的阳性单菌落，37℃200r/min震荡培养12h；然后，分别按1:100比例接种于含卡那霉素的LB中，37℃220r/min摇菌至菌液OD600nm＝0.6～0.8，再加入加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mmol/L，然后在30℃220r/min振荡6h，每隔30min收集含有pET-28a-optiVP2的菌液0.5ml，观察随时间变化的表达情况，离心收集沉淀。1.2.2.5SDS-PAGE电泳鉴定表达产物取2.5ml的步骤1.2.2.4获得的含重组质粒pET-28a-opt本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于卵黄抗体制备的中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因原核表达，其特征是：根据大肠杆菌对密码子的偏好性获得的稀有密码子改造的中华蜜蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因，是SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于卵黄抗体制备的中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因原核表达，其特征是：根据大肠杆菌对密码子的偏好性获得的稀有密码子改造的中华蜜蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：马鸣潇，费东亮，李慧，张皓淳，李永森，
申请(专利权)人：锦州医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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