一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法，首先制备安卡拉免疫抗原，用安卡拉免疫抗原对健康蛋鸡进行免疫，获得合格的鸡蛋，采取蛋黄，用醋酸-醋酸钠缓冲液进行稀释，取上清液，加入饱和硫酸铵溶液，离心、沉淀、过滤后，加入灭菌生理盐水，然后进行超滤，加入质量体积比为1：130~180的β-环糊精、1：150~230的谷氨酸钠、1：5~20的脱脂奶粉、1：10~30的可溶性淀粉混合均匀后进行干燥，最终制得卵黄抗体干粉制剂，本发明专利技术过滤时间短，蛋白不易变性，不易损失蛋白，所得的卵黄抗体对安卡拉病的治疗效果显著，见效时间快，使用效果好，病鸡死亡率低。

Method for preparing anti Ankara virus chicken egg yolk antibody

The invention relates to a preparation method of an anti Ankara virus of chicken egg yolk antibody, first prepared Ankara antigen to immunize laying hens in Ankara healthy immune antigen, obtain qualified egg, take egg yolk, dilute with acetic acid sodium acetate buffer and the supernatant liquid, adding saturated ammonium sulfate solution, centrifugation, precipitation and after filtration, adding sterilized saline, then ultrafiltration, soluble starch mixed with the quality of the volume ratio of 1:130~180 beta cyclodextrin, 1:150~230 sodium glutamate, 1:5~20 and 1:10~30 in skim milk after uniform drying, finally prepared egg yolk antibody powder preparation, filtration time of the invention is short, not easy to protein denaturation, not easy loss of protein, the treatment effect of the yolk antibody of Ankara disease significantly, fast response time, good use effect, disease of chicken deaths Low rate.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，尤其涉及一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法。
技术介绍
心包积水—肝炎综合征(Hydropericardiumhepatitissyndrome，HHS)是由血清4型禽腺病毒(Fowladenovirusserotybe4，FAV4)引起的一种新型家禽疾病。典型症状是3-5周龄肉鸡突然死亡，并伴随有心包积水和肝炎，因此而得名。又因其首次发现于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，故又名安卡拉病（Angraradisease）。安卡拉病通过机械方式和污染物在肉鸡群间水平传播和接触性传播。因为安卡拉病在家禽不出现特别的临床症状，所以在症状出现之前就作出临床诊断是困难的。该病最先在巴基斯坦的3-5周龄肉鸡群发现，鸡群有超过50％死亡率，有的鸡场死亡率甚至高达80%。如此高的死亡率给养禽业带来了极大的损失。由于安卡拉病暂无有效的治疗方案，抗病毒效果不理想。在临床上用已感染的肝脏匀浆制备的自家福尔马林灭活苗可降低死亡率并在预防上已被应用。用在鸡胚肝脏细胞生长病毒的细胞培养物制备的疫苗也可产生保护力。但防控效果仍待观察。卵黄抗体（IgY），是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。鸡IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但在结构上有所不同，因其具有较好的稳定性，能够耐酸碱、耐热、耐蛋白酶水解，甚至其酶解片段还具有部分抗体活性；并且卵黄中的抗体浓度能长期维持相当于甚至超过血清抗体浓度的水平，同时从卵黄中提取抗体无需采血和损伤，能大大降低应激。因此，特异性的卵黄抗体具备易操作、产量高的特点。但现有的提取技术主要以酸化水进行稀释搅拌，脂质与杂蛋白沉淀效率不高，导致提取时间长，抗体活性下降。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高效的抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法。本专利技术的目的是这样实现的：一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于：其步骤如下：步骤1）、安卡拉免疫抗原的制备：将检测为安卡拉阳性的病料组织按1：5(w/V)加入含青霉素1000U/mL和链霉素1000U/mL的灭菌PBS液；将上述加入PBS液后的组织在捣碎机中捣碎，在-20℃环境中，反复冻融3次，用无菌医用纱布过滤；在所得的滤液中加入总体积0.5%量的甲醛，置于37℃恒温设备中灭活24h，用0.22μm的细菌滤器过滤除菌，即可得到安卡拉免疫抗原；步骤2）、蛋鸡的免疫：选取健康蛋鸡，在140日龄时使用安卡拉免疫抗原对健康蛋鸡进行首次免疫，在首次免疫后14日和28日后分别进行加强免疫；首次加强免疫后每隔7天进行抗体检测，收集检测合格的鸡蛋；步骤3）、卵黄抗体粗提液的制备：a）、将检测合格的鸡蛋蛋黄分离后，按照1：8的比例加入pH为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液进行稀释，将稀释后的蛋黄液pH值调节到5.0，搅拌30min使其形成均匀的蛋黄液；在4℃环境下静置4-6小时，取上清液备用；b）、在20℃水浴条件下，向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌并使硫酸铵的浓度达到40%，在20℃水浴中静置1小时，然后在4℃环境下以3500r/min的转速，将加入硫酸铵后的上清液离心15min，收集沉淀；c）、用与起始蛋黄等体积的灭菌生理盐水溶解所获得的沉淀，用0.45μm的滤膜过滤；d）、将c）中得到的滤液加入生理盐水，使用截留量为30kd的滤膜进行超滤，检测无硫酸铵后停止，所得溶液即为卵黄抗体粗提液；步骤4）、卵黄抗体粗提液的干燥：卵黄抗体粗提液检测合格后，分别加入质量体积比为1：130~180的β-环糊精、1：150~230的谷氨酸钠、1：5~20的脱脂奶粉、1：10~30的可溶性淀粉后混合均匀，在喷雾干燥器中以190℃进风温度、70℃出风温度的条件进行喷雾干燥，最终制得卵黄抗体干粉制剂。所述的捣碎机的转速为10000rpm，捣碎时间为2min。所述的卵黄抗体粗提液检测合格后，分别加入质量体积比为1：150的β-环糊精、1：200的谷氨酸钠、1：10的脱脂奶粉、1：20的可溶性淀粉后混合均匀。本专利技术提取安卡拉病鸡组织并制成匀浆液，以青霉素和链霉素进行灭菌，恒温灭活后作为免疫抗原；用该抗原强化免疫产蛋母鸡，获得高免蛋；醋酸-醋酸钠缓冲液具有除脂效果好，时间短，降低蛋白变性的优点，因此利用醋酸-醋酸钠缓冲液从高免蛋黄提取抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体粗品，最后进行超滤处理，于透析相比，超滤所使用的时间更短，卵黄抗体不能透过30kd滤膜，不会损失蛋白。用β-环糊精、谷氨酸钠、脱脂奶粉、可溶性淀粉对卵黄抗体粗提液进行干燥，能够较好的保证卵黄抗体粗提液的活性，降低蛋白变性的可能。所得的卵黄抗体对安卡拉病的治疗效果显著，见效时间快，使用效果好，病鸡死亡率低。具体实施方式抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其步骤如下：步骤1）、安卡拉免疫抗原的制备：将检测为安卡拉阳性的病料组织按1：5(w/V)加入含青霉素1000U/mL和链霉素1000U/mL的灭菌PBS液中；将上述加入PBS液后的组织在捣碎机中捣碎，在10000rpm的转速下，捣碎2min；在-20℃环境中，反复冻融3次，用无菌医用纱布过滤；在所得的滤液中加入总体积0.5%量的甲醛，置于37℃恒温设备中灭活24h，用0.22μm的细菌滤器过滤除菌，即可得到安卡拉免疫抗原；步骤2）、蛋鸡的免疫：选取健康蛋鸡，在140日龄时使用安卡拉免疫抗原对健康蛋鸡进行首次免疫，在首次免疫14日和28日后分别进行加强免疫；首次加强免疫后每隔7天进行抗体检测，收集检测合格的鸡蛋；步骤3）、卵黄抗体粗提液的制备：a）、将检测合格的鸡蛋蛋黄分离后，按照1：8的比例加入pH为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液进行稀释，将稀释后的蛋黄液pH值调节到5.0，搅拌30min使其形成均匀的蛋黄液；在4℃环境下静置4-6小时，取上清液备用；b）、在20℃水浴条件下，向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌并使硫酸铵的浓度达到40%，在20℃水浴中静置1小时，然后在4℃环境下以3500r/min的转速，将加入硫酸铵后的上清液离心15min，收集沉淀；c）、用与起始蛋黄等体积的灭菌生理盐水溶解所获得的沉淀，用0.45μm的滤膜过滤；d）、将c）中得到的滤液加入生理盐水，使用截留量为30kd的滤膜进行超滤，检测无硫酸铵后停止，所得溶液即为卵黄抗体粗提液；步骤4）、卵黄抗体粗提液的干燥：卵黄抗体粗提液检测合格后，分别加入质量体积比为1：150的β-环糊精、1：200的谷氨酸钠、1：10的脱脂奶粉、1：20的可溶性淀粉后混合均匀，在喷雾干燥器中以190℃进风温度、70℃出风温度的条件进行喷雾干燥，最终制得卵黄抗体干粉制剂。实例一：抗安卡拉鸡卵黄抗体粗提液的活性对比酸化水法：将安卡拉高免卵黄按1：9比例用pH5.0的纯化水进行稀释，搅拌均匀后，用HCl调节pH值为5.0-5.2，4℃静置过夜；4℃环境下以3500r/min的转速离心25min，弃去沉淀，收集上清；上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，并使硫酸铵的浓度达到40%；20℃水浴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于：其步骤如下：步骤1）、安卡拉免疫抗原的制备：将检测为安卡拉阳性的病料组织按1：5(w/V)加入含青霉素1000 U/mL和链霉素1000 U/mL的灭菌PBS液；将上述加入PBS液后的组织在捣碎机中捣碎，在‑20℃环境中，反复冻融3次，用无菌医用纱布过滤；在所得的滤液中加入总体积0.5%量的甲醛，置于37℃恒温设备中灭活24h，用0.22 µm的细菌滤器过滤除菌，即可得到安卡拉免疫抗原；步骤2）、蛋鸡的免疫：选取健康蛋鸡，在140日龄时使用安卡拉免疫抗原对健康蛋鸡进行首次免疫，在首次免疫后14日和28日后分别进行加强免疫；首次加强免疫后每隔7天进行抗体检测，收集检测合格的鸡蛋；步骤3）、卵黄抗体粗提液的制备：a）、将检测合格的鸡蛋蛋黄分离后，按照1：8的比例加入pH为5.0的醋酸‑醋酸钠缓冲液进行稀释，将稀释后的蛋黄液pH值调节到5.0，搅拌30min使其形成均匀的蛋黄液；在 4℃环境下静置4‑6小时，取上清液备用；b）、在20℃水浴条件下，向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌并使硫酸铵的浓度达到40%，在20℃水浴中静置1小时，然后在4℃环境下以3500r/min的转速，将加入硫酸铵后的上清液离心15min，收集沉淀；c）、用与起始蛋黄等体积的灭菌生理盐水溶解所获得的沉淀，用0.45μm的滤膜过滤；d）、将c）中得到的滤液加入生理盐水，使用截留量为30kd的滤膜进行超滤，检测无硫酸铵后停止，所得溶液即为卵黄抗体粗提液；步骤4）、卵黄抗体粗提液的干燥：卵黄抗体粗提液检测合格后，分别加入质量体积比为1：130~180的β‑环糊精、1：150~230的谷氨酸钠、1：5~20的脱脂奶粉、1：10~30的可溶性淀粉后混合均匀，在喷雾干燥器中以190℃进风温度、70℃出风温度的条件进行喷雾干燥，最终制得卵黄抗体干粉制剂。...

【技术特征摘要】
1.一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于：其步骤如下：
步骤1）、安卡拉免疫抗原的制备：将检测为安卡拉阳性的病料组织按1：5(w/V)加入含青霉素1000U/mL和链霉素1000U/mL的灭菌PBS液；将上述加入PBS液后的组织在捣碎机中捣碎，在-20℃环境中，反复冻融3次，用无菌医用纱布过滤；在所得的滤液中加入总体积0.5%量的甲醛，置于37℃恒温设备中灭活24h，用0.22μm的细菌滤器过滤除菌，即可得到安卡拉免疫抗原；
步骤2）、蛋鸡的免疫：选取健康蛋鸡，在140日龄时使用安卡拉免疫抗原对健康蛋鸡进行首次免疫，在首次免疫后14日和28日后分别进行加强免疫；首次加强免疫后每隔7天进行抗体检测，收集检测合格的鸡蛋；
步骤3）、卵黄抗体粗提液的制备：a）、将检测合格的鸡蛋蛋黄分离后，按照1：8的比例加入pH为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液进行稀释，将稀释后的蛋黄液pH值调节到5.0，搅拌30min使其形成均匀的蛋黄液；在4℃环境下静置4-6小时，取上清液备用；b）、在20℃水浴条件下，向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌并使硫酸铵的浓度达到40%，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈龙彪，郑鸣，赵圣振，秦伟峰，
申请(专利权)人：河南欧普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41