The invention belongs to the field of biological medicine, and relates to the preparation and application of a specific single chain antibody against avian origin, in particular to a method for preparing an avian genetic engineering antibody against canine parvovirus. The method of avian genetic engineering antibody to a process for the preparation of canine parvovirus, which comprises the following steps: (1) immunity of canine parvovirus like particles; (2) the establishment of phage antibody library of avian phage antibody; (3) by phage display technology of step (2) single chain antibody were obtained screening of specific anti canine parvovirus antibody; (4) based on the step (3) specific anti canine parvovirus antibody obtained by avian gene engineering antibody by prokaryotic expression.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种特异性禽源单链抗体的制备和应用，具体涉及一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法。
技术介绍
犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属。从发现该病毒至今，世界各地均有流行，是危害犬类的最主要的烈性传染病之一。健康犬经消化道感染病毒后，病毒主要攻击两种细胞，一种是肠上皮细胞，一种是心肌细胞，分别表现胃肠道症状和心肌炎症状，心肌炎以幼犬多见。犬接触细小病毒后在3～14天内出现体症，平均发病时间为5～7天。临床症状包括：食欲下降、沉郁、发热、呕吐、腹泻、粪便带有犬细小病毒特有的腥臭味。犬细小病毒至今没有特效药物，但是可以通过止吐止拉等手段控制住病犬脱水情况，降低病犬负担来治疗。理论上诊断本病的方法很多，适合临床医生的有以下四种：1.流行病学诊断本病不分年龄，均可感染，主要是幼犬。直接接触或间接接触感染，主要通过消化道感染。2.症状学诊断特征症状是呕吐、拉稀、拉血。具体根据早中期的症状来诊断。3.血常规检查白细胞总数明显减少，多数犬(92％)在9×109/L以下，少数犬(15％)在2×109/L以下。如果继发细菌感染，白细胞总数可增高。4.试纸快速诊断法用北京军事医学科学院实验动物中心研制的犬细小病毒快速诊断试纸诊断本病，经济简便、快速适用，有极高的准确率。由于禽源抗体多样性主要是通过基因重组实现，扩增抗体可变区基因只需设计一对引物就可达到目的，不同于哺乳动物通过体细胞突变来增加抗体多样性，需要设计多对引物实现可变区基因的扩增。这在抗体可变区基因的获得上优于哺乳动物抗体库的构建，保证...
【技术保护点】
一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)犬细小病毒样粒子的免疫(11)选取生产状态良好的60～70日龄未开产母鸡5只；(12)将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对步骤(11)中的母鸡进行初次免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂；(13)初次免疫14天后，对步骤(2)中的母鸡依次进行四次加强免疫，每次加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为不完全弗氏佐剂；(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立(21)待步骤(13)中的母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，‑80℃储存；(22)使用总RNA提取试剂盒提取步骤(21)得到的脾脏组织的总RNA；(23)对步骤(22)得到的脾脏组织总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA；(24)使用两对特异性引物以脾脏组织cDNA为模板分别扩增轻链可变区和重链可变区，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段,其中，两对特异性引...
【技术特征摘要】
1.一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)犬细小病毒样粒子的免疫(11)选取生产状态良好的60～70日龄未开产母鸡5只；(12)将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对步骤(11)中的母鸡进行初次免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂；(13)初次免疫14天后，对步骤(2)中的母鸡依次进行四次加强免疫，每次加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为不完全弗氏佐剂；(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立(21)待步骤(13)中的母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，-80℃储存；(22)使用总RNA提取试剂盒提取步骤(21)得到的脾脏组织的总RNA；(23)对步骤(22)得到的脾脏组织总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA；(24)使用两对特异性引物以脾脏组织cDNA为模板分别扩增轻链可变区和重链可变区，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段,其中，两对特异性引物包括引物HF-Sif I、引物HR-Linker、引物LF-Linker和引物LR-Not I，引物HF-Sif I:5’-ATGTCTATGGCCCAGCCGGCCGTGACGTTGGACG-3’；引物HR-Linker:5’-CAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAGGAGACGATGAC-3’；引物LF-Linker:5’-TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCT-3’；引物LR-Not I:5’-AGTTACTGGAGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGGG-3’；(25)建立噬菌体抗体库(251)将步骤(24)获得的禽源单链抗体片段分别用引物Sif I和引物Not I酶切，再将pCANTAB5E噬菌粒载体分别用引物Sif I和引物Not I酶切；(252)将步骤(251)得到的酶切产物经胶回收后，使用T4-DNA连接酶将酶切禽源单链抗体片段与酶切pCANTAB5E噬菌粒载体连接在一起；(253)将步骤(252)得到的连接产物转化入TG1大肠杆菌中，并将其涂布于SOB固体培养基上，30℃，培养12-16小时，其中该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；(254)将步骤(253)中SOB固体培养基上的菌落用5mL 2×YT培养基洗脱下来，加入等体积的50％灭菌甘油，放入-80℃存储备用；(3)通过噬菌体展示技术对步骤(2)得到的单链抗体进行筛选，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体；(4)基于步骤(3)得到的特异性抗犬细小病毒单链抗体通过原核表达获得禽源基因工程单链抗体。2.根据权利要求1所述的一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，其特征在于，步骤(3)包括以下步骤：(301)将3mL步骤(2)得到的噬菌体抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养，该2×YT培养基含有5ml 20wt％的葡萄糖水溶液；(302)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(301)中的培养基的细菌浓度，待步骤(301)中的培养基的菌液OD600为0.4～0.6时，向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；(303)将步骤(302)中的培养基离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀，其中，离心时的离心力为5000×g；(304)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(303)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养过夜；(305)用2mL浓度为10μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第一免疫管，4℃孵育12～16小时备用；(306)将步骤(304)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；(307)将步骤(306)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；(308)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(307)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；(309)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(308)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；(310)将步骤(305)得到的第一免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；(311)再将步骤(310)中的第一免疫管中的封闭液倒去，再用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；(312)将步骤(309)得到的混合液加入步骤(311)的第一免疫管内，37℃静置温育2h；(313)弃去步骤(312)中第一免疫管的混合液，用含有0.2v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第一免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；(314)向步骤(313)中的第一免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中,其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；(315)向步骤(314)中空的第一免疫管加入4mL对数期TG1菌液洗涤，然后将第一免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液加入步骤(314)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得一级抗体库，然后取0.01ml的一级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；(316)将2mL步骤(315)得到的一级抗体库加入到250mL的2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；(317)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(316)培养基中的细菌浓度，待步骤(316)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；(318)将步骤(317)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；(319)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(318)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养12～16小时；(320)用2mL浓度为5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第二免疫管，4℃孵育12～16小时备用；(321)将步骤(319)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一经...
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