识别HPV16阳性肿瘤细胞的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种识别HPV16阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用，该抗体能够高特异性地检测肿瘤细胞中的宫颈癌生物标志HPV16E7蛋白，从而能够区分癌变的宫颈上皮细胞和宫颈异常或非癌变宫颈上皮细胞，为医生准确诊断HPV感染所导致的癌症带来依据，可有效降低高级别宫颈病变的漏诊率，为临床医师对患者诊疗提供充分的时间与依据，改善前期宫颈疾病检测和早期干预。同时，也可以减少和避免不必要的阴道镜检查。

Monoclonal antibodies recognizing HPV16 positive tumor cells and uses thereof

The present invention provides a monoclonal HPV16 positive cervical epithelial cancer cell antibody and its application, the antibody can specific detection of cervical cancer biomarkers of HPV16E7 protein in tumor cells, which can differentiate between cancer cells and cervical epithelial abnormalities or non cancerous cervical epithelial cells, bring the basis for doctors to accurate diagnosis of HPV infection cause cancer, can effectively reduce the high misdiagnosis rate of cervical lesions, provides clinicians with time and sufficient basis for patients with cervical disease diagnosis and treatment, early detection and early intervention. At the same time, can also reduce and avoid unnecessary colposcopy.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物诊断及医药领域，具体地说，本专利技术涉及识别人乳头状瘤病毒(HPV)16亚型阳性肿瘤细胞，包括人宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
子宫颈癌是第二位常见女性恶性肿瘤,全球每年大约有50万女性被诊断为宫颈癌，其中超过半数的女性因此而死亡。1976年德国科学家HaraldZurHausen提出HPV可能是性传播致癌因素之后，HPV感染与宫颈癌关系的研究成为肿瘤病毒病因研究的热门课题。2008年HaraldzurHausen因证明了HPV病毒是导致宫颈癌的病原体而获得了诺贝尔生理医学奖。大量研究发现,人乳头瘤病毒HPV不仅是导致宫颈癌的元凶，同时还可以引起多种其它肿瘤,包括生殖道、乳腺、消化道及呼吸道癌症。作为目前唯一病因明确的癌症，宫颈癌是唯一可以通过早期筛查、早期发现、彻底防治的癌症。80％女性一生中都会感染HPV病毒，通常病毒在1-2年内会自然清除，仅25％左右会发生癌前病变。宫颈癌早期症状并不明显，发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期。从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。据统计，约20％的低度宫颈损伤将转变为高度损伤，如果不及时治疗，其中30％将会进一步转为为恶性肿瘤。因此，HPV感染导致的癌前病变的早期诊断是降低宫颈癌等相关疾病死亡率和减少宫颈癌治疗开支的重要突破口。2012年美国癌症学会(ACS)、美国阴道镜检查与宫颈病理学会(ASCCP)和美国临床病理学会(ASCP)建议，宫颈癌筛查的最佳策略是既能识别可能进展为浸润癌的癌前病变，又能避免对未必会有恶性进展的一过性HPV感染及其相应良性病变的探查和不必要治疗。目前，临床上常用的宫颈癌筛查方法共有四种：传统巴氏涂片(Pap)、醋酸碘涂抹试验(VIA/VILI)、液基细胞学检测(LBC)和人乳头瘤状病毒核酸检测(HPVDNA)。液基细胞学检测(LBC)采用TBS报告系统：包括正常细胞学涂片；良性细胞学改变；鳞状上皮细胞异常；腺体细胞异常；来源于子宫外的其他恶性肿瘤。其中鳞状上皮异常又分为：意义未明的不典型鳞状上皮细胞(ASC-US)；不典型鳞状细胞，不除外高度鳞状上皮内病变(ASC-H)；低度鳞状上皮内病变(LSIL)；高度鳞状上皮内病变(HSIL)以及鳞癌(SCC)。目前市场上广泛使用的液基细胞学检测有美国Hologic的TCT(CytologicTest)，BD公司的LCT(BDSurePathTM)和国产广州安必平公司的LBP。但使用细胞学方法检测CIN2及更高级别病变时的敏感性较低，细胞学对于癌前病变不具有非常好的特异性，实验室间的结果差异大，且筛查间隔频繁，至少每2-3年就要进行检测。2015年美国癌症协会(ACS)最新发布的指南推荐初筛采用人乳头状瘤病毒(HPV)检测，但对我国卫生资源缺乏的地区，这种技术没有实际应用条件，且HPVDNA检测也无法区分HPV是瞬时感染或是持续感染。加上我国缺乏有资质的细胞学医生，因此我国宫颈癌筛查和早诊早治的工作还有很长的路要走。已证实宫颈癌和高危型的HPV如HPV16，18型的感染之间的强关联性。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，包括6个早期开放读码框架、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要。Ziegent(2003)等研究已证实HPVE6、E7基因具有细胞转化功能,是潜在的癌基因,编码HPVE6、E7蛋白为癌蛋白,在体外能转化小鼠上皮细胞,也能使人类上皮细胞发生永生化,而且HPVE6、E7蛋白的持续表达是维持体外培养细胞永生化所必需的。因此，高危型HPV的早期表达蛋白E6和E7在宫颈癌的发生中起着重要作用。癌症发生过程中病毒DNA整合入人体细胞基因组内，随着E6和E7蛋白表达控制的缺失，在高度宫颈非典型增生和宫颈癌病人的上皮细胞内持续表达E6和E7蛋白。E7是肿瘤原性蛋白，且具有较强的抗原性，能够使肿瘤抑癌基因pRb失活，最终引起细胞生长失控，导致细胞永生化而发生癌变。这使得E7可作为高度宫颈损伤和宫颈癌检测的一个肿瘤标志物。目前临床免疫组化检测HPV感染主要是采用HPVL1和其他一些辅助生物标志，如p16INK4A，Ki67,hTERT等(ValentinaF，RenzoB，SerenaB，etal.DetectionofHPVE7Oncoviralproteinincervicallesionsbyanewantibody.ApplimmunohistochemMolMorphol,2013,21(4):341-350)。临床HPV检测没有合适的抗体主要有三个原因：1，HPV蛋白在临床组织或细胞样本中表达量较低，需要高度亲和力的抗体进行检测；2，HPV病毒在现有的标准组织培养技术下不能在实验室培养存活；3，E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采用E7蛋白免疫动物不能获得很好的免疫反应，另外使制备得到的抗体往往与其他的HPV蛋白存在交叉反应，对E7蛋白不具有特异性。因此，需要提供一种用于诊断高度子宫颈病变的方法，该方法不依赖于常规的Pap涂片检查和针对高危HPV感染的分子检测或者与其一起联用。该方法应当能够特异性地鉴定存在于所有患者群体中的高度子宫颈病变，尤其能够对细胞学检测被分类为LSIL或CINII、而实际上是高度病变的病例或者有发展为高度病变的重大可能性的病例进行分流。因此本领域需要这样的特异的、可靠的诊断方法，该方法能够检测高度子宫颈疾病以及能够区分HPV持续感染导致的组织破坏和不被当作临床疾病的病症例如早期HPV感染和轻度发育异常。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够识别HPV16阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.:4所示的CDR1，SEQIDNO.:6所示的CDR2，和SEQIDNO.:8所示的CDR3。在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQIDNO.:10所示的氨基酸序列。本专利技术的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本专利技术第一方面所述的重链可变区，和重链恒定区。在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源。本专利技术的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：SEQIDNO.:12所示的CDR1'，SEQIDNO.:14所示的CDR2'，和SEQIDNO.:16所示的CDR3'。在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQIDNO.:18所示的氨基酸序列。本专利技术的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本专利技术第三方面所述的轻链可变区，和轻链恒定区。在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源。本专利技术的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：(1)如本专利技术第一方面所述的重链可变区；和/或(2)如本专利技术第三方面所述的轻链可变区。在另一优选例中，所述抗体具有：如本专利技术第二方面所述的重链；和/或如本专利技术第四方面所述的轻链。在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性抗HPV16的抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV16E7蛋白的抗体。较佳地，所述抗体还具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:4所示的CDR1，SEQ ID NO.:6所示的CDR2，和SEQ ID NO.:8所示的CDR3；优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.:4所示的CDR1，SEQIDNO.:6所示的CDR2，和SEQIDNO.:8所示的CDR3；优选地，所述重链可变区具有SEQIDNO.:10所示的氨基酸序列。2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区和重链恒定区。3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：SEQIDNO.:12所示的CDR1'，SEQIDNO.:14所示的CDR2'，和SEQIDNO.:16所示的CDR3'；优选地，所述的轻链可变区具有SEQIDNO.:18所示的氨基酸序列。4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区和轻链恒定区。5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：如权利要求1所述的重链可变区；和/或如权利要求3所述的轻链可变区；或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；或(2)如权利要求6所述的重组蛋白。8.一种载体，其特征在于，它含有本发明权利要求7所述的多核苷酸。9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。11.一种药物组合物，其特征在于，它含有：(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻...

【专利技术属性】
技术研发人员：常小迦，韩凤丽，时成龙，
申请(专利权)人：艾托金生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32