作为用于HPV-阳性妇女的分类工具的对自身样品的甲基化分析制造技术

本发明专利技术人目前已经开发出了在通过自我取样获得的细胞材料内基于标记物MAL和hsa-miR124中的改变(特别是启动子高甲基化)的检测的(分子)诊断检验，用以鉴定人乳头瘤病毒(HPV)-诱导的重度癌前期病变如浸润性宫颈癌的癌前宫颈病变。具体地，本发明专利技术涉及MAL基因(包含它的启动子)和hsa-miR124基因作为用于HPV-诱导的重度癌前病变的标记物的应用，允许个体患者的早期检测和更好的治疗选择。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为用于HPV-阳性妇女的分类工具的对自身样品的甲基 化分析
本专利技术涉及癌症预防和医学诊断学的领域；并且涉及用于人乳头瘤病毒 (HPV)-诱导的浸润性（侵袭性，invasive)癌症和它的重度前期病变（precursor lesion) 的分子诊断检验，如浸润性宫颈癌和癌前（恶化前，premalignant)宫颈病变。具体地，本 专利技术涉及对（hrHPV-阳性）自我取样的样本的MAL和hsa-miR124启动子甲基化的综合分 析在用于具有侵润性可能（浸润潜能）的hrHPV-诱导的癌前病变和hrHPV-诱导的浸润性 癌症的检验中的应用。
技术介绍
子宫颈癌症是世界范围内女性第二大常见癌症且导致一年约250000癌症死亡。 子宫颈鳞状细胞癌发展的特征是一系列癌前病变，所谓的宫颈上皮肉瘤样病变 (CIN)，将其分为1至3等级，分别指的是轻度异生（CIN1)，中度异生（CIN2)和重度异生/ 原位癌（CIN3)。也将CIN1称为轻度鳞状上皮内病变（LSIL)并且同时将CIN2和CIN3称为 重度鳞状上皮内病变（HSIL)。对于子宫颈腺癌，原位腺癌（ACIS)是已确定的前期病变。原 则上，尽管病变越严重，自发消退的可能性越低，但是这些癌前病变是可逆的。认为宫颈癌 是可预防性疾病，因为，可通过脱落细胞学检测癌变前阶段和在必要时，相对容易地治疗， 仅具有较小的副作用。子宫颈筛查目的在于早期诊断重度癌变前的（也就是，CIN2/3和原 位腺癌）和能治疗的癌病变，因此减少浸润性宫颈癌的死亡率。通用医疗实践包括具有形 态学上确定的CIN2、CIN3和原位腺癌的所有的女性的治疗，以便避免宫颈癌的发展。 在过去的十年里，已经确定了，通过具有高危型人乳头瘤病毒（hrHPV)的感染开 始子宫颈致癌作用。已经显示了病毒性致癌基因 E6和E7的表达对肿瘤发生的开始和恶性 表型的维持是必不可少的，E6和E7分别干扰p53和Rb肿瘤抑制路径。因此，对hrHPV的测验 表现为有吸引力的，初步的筛选装置。然而，与致癌作用的多步过程一致，宿主细胞基因组 中的另外的变化是hr-HPV受感染细胞至浸润性癌细胞的发展必须的。只有少部分感染高 危型HPV的女性将发展为重度癌变前宫颈病变（CIN2/3)，并且如果没有治疗，将发展为宫 颈癌。在大多数具有癌变前宫颈病变的女性中，病变自发地消退。关于参与荷兰人口基数筛 查的女性，约5-6%具有阳性111'册￥检验出1111〇1^118等人，11^1031?^12004，110:94-101)。 然而，他们中最多只有20% (参与的女性的1%)具有彡CIN2/3。因此，通过hrHPV检验的 初步筛选将兼有大量多余的后续程序和对女性造成不必要的焦虑，除非可将标记物应用于 子宫颈刮片，其允许为彡CIN2/3和彡原位腺癌的危险的hrHPV阳性的女性的分层。 已经在多个国家中建立了以医师-采取的刮片为基础的庞大的基于人群的筛选 方案。然而，将显示不是所有的参与的女性都实施了子宫颈刮片检查。由不情愿通过护士 或医师对这些女性实施子宫颈涂片检查的女性引起许多未显示。研究已经显示，可通过向 这些女性提供用于在家里进行（子宫颈）阴道材料的自我采集的设备克服这点，可将其发 送给实验室，用于HPV分析。同样地，自我取样增加非响应者在现有的筛选程序中的参与 (Gdk等人2010Brit. Medical J. ;340:cl040)。自我取样是用于子宫颈筛查的便宜的和被 广泛接受的方法。更多地，因为HPV分析用于CIN2+/3+的检测在自我收集的样品上可如医 师收集样品一样好，自我取样在将来可变成用于初级宫颈癌筛查的可替换的方法。因而，在 未来几年内，（子宫颈）阴道材料的自我取样将变成宫颈癌的筛查的重要装置。 主要的挑战是减少hrHPV阳性的女性占具有临床上有意义的病变的百分比。然 而，在传统的刮片上，细胞学可担当对hrHPV阳性的女性的第二（所谓的分类）检验，细胞 学不是可在家里获取的自我取样的宫颈阴道样本的选择，因为这些不是子宫颈的细胞学状 态的典型（Brink etal.，2006, J. Clin.微biol. 44:2518-2523)。因此，需要补充的或可替 换的分类装置，以便将hrHPV阳性女性分层为具有和没有彡CIN2/3和彡原位腺癌的那些。 早前已经显示了（W02009/128714)，当应用于完全等同于细胞学执行的医师收集 的子宫颈刮片时，编码T-淋巴细胞成熟相关的蛋白，也称为T-细胞分化蛋白的基因（进 一步称为MAL ;Genbank登录号NM002371. 2)和编码细胞粘附分子1 (CADM1)的基因的启动 子甲基化的综合检验出现有吸引力的可替换的分子分类装置（Hesselink等人2011Clin Cancer Res. 17 (8) : 2459-65)。然而，这组检验不能很好地在自我取样的子宫颈-阴道样本 上执行，主要因为，具有彡CIN2/3的女性的自我取样样品中的CADM1甲基化的信号比医师 收集的子宫颈样品的情况中更频繁地在检验阈值之下。 因此，仍然需要可在自我取样样品上实施，并且可给予发展中的宫颈病变的存在 或风险的更可靠的指示的检验。
技术实现思路
现在已经出人意外地发现了，当应用于对hrHPV检验呈阳性的自我取样的样本 时，对编码T-淋巴细胞成熟相关的蛋白，也称为T-细胞分化蛋白的基因（进一步称为 MAL ;Genbank登录号NM_002371. 2)和由3位于三个不同的基因组区域上的3个个体早 熟微RNA(microRNA)序列编码的微RNA hsa-miR124(登录号MIMAT0000422)的启动子甲 基化的综合检验，这3个个体早熟微RNA也就是在染色体8p23. 1上的HSA-MIR124-1 (登 录号MI0000443)，在染色体8ql2. 3上的HSA-MIR124-2 (登录号MI0000444)和在染色 体20ql2. 33上的HSA-MIR124-3 (登录号MI0000445)(如在miRNA数据库上指示登录号， miBase (www. mirbase. orR)，曼切斯特大学，生命科学系），两者在宫颈癌细胞中都具有肿瘤 抑制性能，提供用于诊断浸润性宫颈癌和它的重度前期病变的有价值的检验。 因此，本专利技术涉及检测或预测HPV-诱导的重度癌前期病变和/或HPV-诱导的浸 润性癌症的发生的方法，包括检验宫颈-阴道自身样品（self-sample)的T-淋巴细胞成熟 相关的蛋白（MAL)和/或hsa-miR124的甲基化的变化的存在，其中所述变化指示具有浸润 潜能的HPV-诱导的前期病变和/或HPV-诱导的浸润性癌的存在或未来的存在。优选地， 在所述方法中，所述HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸润性癌是重度癌变前宫颈 病变或浸润性宫颈癌。同样地，在所述方法中优选的，所述HPV-诱导的浸润性癌是高危型 HPV-诱导的浸润性癌。 在所述方法的另一个实施方式中，与正常的对照样品相比，所述变化是甲基化的 增加。优选地，在本专利技术的方法中，在编码MAL多肽及其调控区以及hsa-miR124序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测或预测HPV‑诱导的重度癌前病变和/或HPV‑诱导的浸润性癌的发生的方法，包括检验宫颈‑阴道自身样品的T‑淋巴细胞成熟相关的蛋白(MAL)和/或hsa‑miR124的甲基化中变化的存在，其中所述变化指示存在或将来存在具有浸润潜能的HPV‑诱导的前期病变和/或HPV‑诱导的浸润性癌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.15 EP 11181492.71. 一种检测或预测HPV-诱导的重度癌前病变和/或HPV-诱导的浸润性癌的发生的方 法，包括检验宫颈-阴道自身样品的T-淋巴细胞成熟相关的蛋白（MAL)和/或hsa-miR124 的甲基化中变化的存在，其中所述变化指示存在或将来存在具有浸润潜能的HPV-诱导的 前期病变和/或HPV-诱导的浸润性癌。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述HPV-诱导的重度癌前病变或HPV-诱导的浸 润性癌是重度癌变前宫颈病变或浸润性宫颈癌。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述HPV-诱导的浸润性癌是高危型HPV-诱 导的浸润性癌。4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与正常的对照样品相比，所述变化是 甲基化的增加。5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对编码MAL多肽及其调控区以及 hsa-miR124序列的核酸检验所述甲基化。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸是DNA。7. 根据权利要求6所述的方法，其中利用限制性内切核酸酶，优选地甲基化敏感的限 制性内切核酸酶实施所述检验。8. 根据权利要求6所述的方法，其中所述试剂是结合到所述核酸上的核酸探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得鲁斯·约瑟夫斯·费丁安杜斯·斯尼杰德尔斯，伦斯克·丹尼拉·玛丽亚·斯泰恩贝尔根，丹尼勒·安妮·玛丽·海德曼，克里斯托弗鲁斯·琼内斯·拉姆贝图斯·玛丽亚·迈耶，
申请(专利权)人：塞尔夫斯库林有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL