检测HPV诱导的浸润性癌症、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症以及它们的高级前体病变的甲基化分类器制造技术

本发明专利技术涉及用于检测HPV诱导的高级癌前病变、HPV诱导的浸润性癌症以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法，所述方法包括检测细胞中的由基因LHX8、ASCL1和ST6GALNAC5以及它们的调节序列组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在具有浸润性潜力的HPV诱导的前体病变、HPV诱导的浸润性癌症以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。本发明专利技术进一步包括由基因LHX8、ASCL1和ST6GALNAC5以及它们的调节序列组成的甲基化分类器在这种方法中的用途，以及用于检测LHX8、ASCL1和/或ST6GALNAC5甲基化的检测试剂盒。

Methylation classifier for detection of HPV induced invasive cancer, non HPV induced gynecological cancer, anogenital cancer and their advanced precursor lesions

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测HPV诱导的浸润性癌症、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症以及它们的高级前体病变的甲基化分类器
本专利技术涉及癌症预防和医学诊断领域；并且关注于癌症，特别是人乳头瘤病毒(HPV)诱导的浸润性癌症及其高级前体病变(比如浸润性宫颈癌症和恶变前宫颈病变)、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的分子诊断测定。特别地，本专利技术涉及基于基因LHX8、ASCL1和ST6GALNAC5以及它们的调节序列的甲基化分类器作为用于hrHPV诱导的浸润性癌症、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症及它们的具有浸润性潜力的恶变前病变的标记物的用途。
技术介绍
子宫颈癌症是全世界女性中第四大常见癌症，并且造成每年约250,000例癌症死亡。宫颈鳞状细胞癌的发展特征是一系列恶变前病变，所谓的宫颈上皮内瘤变(CIN)，其分级为1至3，分别指轻度不典型增生(CIN1)、中度不典型增生(CIN2)和重度不典型增生/原位癌(CIN3)。CIN1也称为低级鳞状上皮内病变(LSIL)，并且CIN2和CIN3一起称为高级鳞状上皮内病变(HSIL)。对于宫颈腺癌，原位腺癌(ACIS)是确定的前体病变。原则上，这些恶变前病变是可逆的，尽管病变越严重，自发消退的机会越低。宫颈癌症被认为是可预防的疾病，因为恶变前阶段可通过脱落细胞学检测，并在必要时相对容易地治疗，只有轻微的副作用。宫颈筛查旨在早期诊断高级恶变前的(即CIN2/3和原位腺癌)和可治疗的癌性病变，从而降低浸润性宫颈癌症的死亡率。一般医疗实践包括治疗所有具有形态学证实的CIN2、CIN3和原位腺癌的女性，以便预防宫颈癌症的发展。在过去十年中，已经公认宫颈癌变是由感染高风险人乳头瘤病毒(hrHPV)引发的。病毒癌基因E6和E7的表达(其分别扰乱p53和Rb肿瘤抑制途径)已显示出对于肿瘤发生的发作和恶性表型的维持都是必需的。因此，测试hrHPV似乎是有吸引力的初级筛选工具。然而，与癌变的多步骤过程一致，hrHPV感染的细胞向浸润性癌细胞的进展需要宿主细胞基因组的额外改变。只有一小部分感染高风险HPV的女性将发展为高级恶变前宫颈病变(GIN2/3)，并且如果不治疗则将发展为宫颈癌症。在大多数具有恶变前宫颈病变的女性中，病变自发消退。在参与基于人群的筛查的女性中，约5-6％测试为阳性hrHPV。然而，她们中只有最多20％(参与女性的1％)具有≥CIN2/3。因此，通过hrHPV测试的初步筛查将伴随大量冗余的随访程序和女性中不必要的焦虑，除非可以将标记物应用于宫颈涂片，以允许hrHPV阳性的女性分层为≥CIN2/3和≥原位腺癌的风险。一项重大挑战是将HPV测试阳性的女性的百分比降低到具有临床意义病变的女性。一种模式是使用细胞学作为hrHPV阳性的女性的二级(所谓的分类)测试。尽管如此，这仍然留下了大量具有正常细胞学的hrHPV阳性的女性(筛查人群中3.5％的女性)，其中仍有10％具有或获得≥CIN3。此外，细胞学不适用于可在家中采集的自体采样宫颈阴道试样，因为这些不能代表宫颈的细胞学状态。另一种模式是使用HPV16/18基因分型。然而，这留下了具有非HPV16/18型的女性，她们(虽然在较小程度上)也存在≥CIN2/3和≥原位腺癌的风险。因此，需要补充或替代的分类工具来将hrHPV阳性的女性分为具有和没有≥CIN2/3和≥原位腺癌的女性。使用基于癌基因中宿主细胞变化的疾病标记物对宫颈癌症进行初步筛查提供了有前景的替代方案，条件是特异性和敏感性足够高。对于缺乏质量控制细胞学并且针对HPV阳性的女性实施后续算法是复杂的低收入和中等收入国家而言，该选择特别令人感兴趣。在这些国家，自体取样已经证明有助于获得宫颈筛查(Laczano-Ponce等，Lancet.2011；378:1868-1873).从这个意义上说，具有在自体样本中也可接受的标记是非常有用的。通过医疗技术人员(如医生或护士)获得的阴道涂片上的标记物和女性自己收集的阴道拭子上的标记物的“行为”似乎有很大差异。似乎许多将适合于医生提供的样本的标记物在自体样本中没有用。在低收入和中等收入国家，利用自体样本而不是医生样本进行工作的必要性很高，因为在这些国家，人均医疗人员较少，并且通常让其他人采取阴道样本存在文化问题。此外，即使在高度发达的国家，自体取样也是降低为大规模宫颈癌症筛查获得阴道样本的成本的理想方法。当尿液样本可用于早期癌症检测时，可以预期甚至更高的接受率。子宫内膜癌症是许多发达国家中最常见的妇科恶性肿瘤(Siegel等，CACancerJ.Clin.,64(2014),9–29页)。早期子宫内膜癌症有非常好的预后。因此，早期检测将增加治愈的机会并避免或减少麻烦和昂贵的治疗性干预。由于已经证明了宫颈刮擦物中肿瘤细胞的脱落，因此通过非侵入性取样来早期检测子宫内膜癌症是可行的。然而，宫颈刮擦物的常规细胞学对子宫内膜癌症的检测敏感性非常低。测试与子宫内膜癌症相关的分子改变(比如DNA甲基化)，可以为早期检测子宫内膜癌症提供有前景的方法(deStrooper等，JClinPathol.2014；67(12):1067-71，Bakkum-Gamez等.GynecolOncol.2015；137(1):14-22)。类似地，最近已经提出了用于检测卵巢癌症的宫颈刮擦物中癌症特异性DNA改变的测试(Kindle等，SciTranslMed.2013；5(167):1-21)。
技术实现思路
专利技术人现已发现一种用于检测HPV诱导的浸润性癌症、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症以及它们的高级癌前病变的方法，其中所述方法包括检测细胞中的LHX8、ASCL1和ST6GALNAC5的基因序列中或这些基因的调节序列中的超甲基化，由此这种超甲基化指示存在具有浸润性潜力的HPV诱导的前体病变、HPV诱导的浸润性癌症和/或非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。优选地，在这种方法中，所述HPV诱导的高级癌前病变或HPV诱导的浸润性癌是高级恶变前宫颈病变或浸润性宫颈癌症，更优选是高风险HPV诱导的浸润性癌症。优选地，所述非HPV诱导的妇科癌症是子宫内膜癌症。优选地，所述非HPV诱导的肛门生殖器癌症是外阴或阴茎癌症。本专利技术还包括用于检测外阴癌症和具有浸润性潜力的外阴HPV诱导的前体病变的方法，所述方法包括检测细胞中的由ZIC1、ZNF-582和LHX8序列中的一个或多个，以及ASCL1组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在外阴癌症和具有浸润性潜力的外阴HPV诱导的前体病变。本专利技术进一步包括用于检测肛门癌症和具有浸润性潜力的肛门HPV诱导的前体病变的方法，所述方法包括检测细胞中的由ZIC1和ZNF-582序列中的一个或多个，以及ASCL1组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在肛门癌症和具有浸润性潜力的肛门HPV诱导的前体病变。本专利技术的另一部分是用于检测卵巢癌症和卵巢前体病变的方法，所述方法包括检测细胞中的由LHX8和ZIC1序列中的一个或多个，以及ASCL1组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在卵巢癌症和卵巢前体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测HPV诱导的高级癌前病变和HPV诱导的浸润性癌症以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法，所述方法包括检测细胞中的由LHX8、ASCL1和ST6GALNAC5序列组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在具有浸润性潜力的HPV诱导的前体病变、HPV诱导的浸润性癌症以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170310 EP 17160346.71.一种用于检测HPV诱导的高级癌前病变和HPV诱导的浸润性癌症以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法，所述方法包括检测细胞中的由LHX8、ASCL1和ST6GALNAC5序列组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在具有浸润性潜力的HPV诱导的前体病变、HPV诱导的浸润性癌症以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述HPV诱导的高级癌前病变或HPV诱导的浸润性癌症是高级恶变前宫颈病变或浸润性宫颈癌症。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述HPV诱导的浸润性癌症是高风险HPV诱导的浸润性癌症。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述非HPV诱导的妇科癌症是子宫内膜癌症或卵巢癌症。


5.用于检测外阴癌症和具有浸润性潜力的外阴HPV诱导的前体病变的方法，所述方法包括检测细胞中的由ZIC1、ZNF-582和LHX8序列中的一个或多个，以及ASCL1组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在外阴癌症和具有浸润性潜力的外阴HPV诱导的前体病变。


6.用于检测肛门癌症和具有浸润性潜力的肛门HPV诱导的前体病变的方法，所述方法包括检测细胞中的由ZIC1和ZNF-582序列中的一个或多个，以及ASCL1组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在肛门癌症和具有浸润性潜力的肛门HPV诱导的前体病变。


7.用于检测卵巢癌症和卵巢前体病变的方法，所述方法包括检测细胞中的由LHX8和ZIC1序列中的一个或多个，以及ASCL1组成的甲基化分类器，由此这种超甲基化指示存在卵巢癌症和卵巢前体病变。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在如图1、2、3、7和8中所指示的富含CpG的序列中检测所述超甲基化。


9.根据权利要求1-4中任一项所述的检测HPV诱导的高级癌前病变和HPV诱导的浸润性癌症以及非HPV诱导的妇科癌症或肛门生殖器癌症的方法，或根据权利要求5所述的检测外阴癌症和具有浸润性潜力的外阴HPV诱导的前体病变的方法，和/或根据权利要求6所述的检测肛门癌症和具有浸润性潜力的肛门HPV诱导的前体病变的方法，和/或用于检测卵巢癌症和卵巢前体病变的方法，其中所述超甲基化是与可比较的正常细胞相比，测试细胞中甲基化分类器LHX8、ASCL1、ZNF-582、ZIC1和/或ST6GALNAC5富含CpG的启动子和/或基因序列的增加的甲基化。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中试剂是选自由BssHII、MspI、NotI和HpaII组成的组中的甲基化敏感性限制性核酸内切酶。


11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法涉及纳米技术，优选芯片上实验室技术。


12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中进行甲基化特异性PCR，所述甲基化特异性PCR基于DNA的亚硫酸氢盐修饰，然后是靶向富含CpG的序列的特异性PCR反应。


13.根据权利要求12所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托夫·约翰内斯·兰贝图斯·玛丽亚·梅耶尔，伦塞克·丹尼拉·玛丽亚·斯坦伯根，彼得鲁斯·约瑟夫斯·费丁南德斯·斯尼德，丹妮尔·安妮·玛丽·海德曼，
申请(专利权)人：塞尔夫斯库林有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL